2022年第三期·肿瘤液体活检临床学术文献汇编
肿瘤液体活检临床学术文献汇编
（2022年第三期）
晶准生物医学（深圳）有限公司
本期文章摘要
本期共摘取三篇文章：
第一篇文章于2020年发表在《Nature Communications》杂志上（影响因子14.92），该项研究揭示了全新的前列腺癌肿瘤模型。探究人员利用晚期CRPC患者血液中的循环肿瘤细胞（CTC）以及异体移植技术，成功建立出可以反映去势抵抗型前列腺癌（CRPC）肿瘤异质性、耐药性的eXplant（CDX）模型以及CDX衍生细胞系，克服了现有模型的局限性，并为探索前列腺癌CTC的致瘤性以及新的靶向策略提供了机会。
第二篇文章于2021年发表在《Oncogene》杂志上（影响因子9.867），作为一次前瞻性研究，该研究首次将激光捕获显微切割（LCM）与甲基化测序（WGBS）技术结合，检测了肺癌患者循环肿瘤细胞DNA（CTC DNA），并进行了单碱基对分辨率的甲基化分析，对肺癌CTC DNA甲基化组学有了全新的认知。该研究可以帮助研究者更深入地理解肿瘤细胞散发和转移机制，为未来开发新的肿瘤生物标志物开拓了更美好的前景。
第三篇文章于2018年发表在《Journal of Clinical Oncology》杂志上（影响因子44.54），该研究开发了新的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）临床指标。传统的检测治疗效果的方法为观察患者前列腺特异性抗原（PSA）水平于不同治疗节点的变化，然而该方法的可靠性并不理想。研究者通过建立weighted c-index模型，发现CTC0（CTC基线>1，第13周CTC为0的患者）和CTC转换点（CTC基线≥5，第13周≤4的患者）是更好的反应疗效的标志物，该结果与Kaplan-Meier生存模型一致，证实了两者均为稳定且可靠的反应终点。
目 录
神经内分泌性前列腺癌CTC构建的eXplant模型的遗传学特征 1
循环肿瘤细胞计数作为转移性去势抵抗性前列腺癌延长生存期的反应指标：与五项随机 III 期临床试验中前列腺特异性抗原的比较 15
Genetic characterization of a unique neuroendocrine transdifferentiation prostate circulating tumor cell-derived eXplant model
神经内分泌性前列腺癌CTC构建的eXplant模型的遗传学特征
发表时间：2020年4月
发表期刊：Nature Communications
巴黎萨克雷大学的Vincent Faugeroux带领的研究团队利用CRPC患者血液中的CTC建立外植体模型（CDX）以及CTC衍生细胞系。与传统模型相比，该模型保留了更完整的肿瘤遗传特性、组织学和表型特征，反映了肿瘤组织的异质性。经过验证，CDX模型也具有对标准化疗的耐药性，可以更准确地模拟标准CRPC治疗中出现的多耐药状况，帮助研究人员筛选出有效的治疗方案，实现精准治疗。
去势抵抗性前列腺癌（CRPC）转化为神经内分泌分化前列腺癌（CRPC-NE）是临床治疗的主要挑战之一，同时也缺乏相应的研究模型。Faugeroux团队通过诊断性白细胞分离法从CRPC患者血液中富集CTC，并建立CTC衍生的外植体模型（CDX， CTC-derived eXplant）和CDX衍生细胞系。CDX和衍生细胞系保留了16％的原发肿瘤（PT）突变、56％的CTC突变以及83％的PT拷贝数畸变，其中包括克隆TMPRSS2-ERG融合和NKX3.1丢失。CDX和衍生细胞系都具有雄激素受体（AR）失效的神经内分泌表型，以及TP53、PTEN和RB1丢失，CTC中也存在PTEN和RB1丢失。进化分析表明，原发肿瘤亚克隆中的TP53丢失是导致肿瘤转移的驱动因素。CDX模型可以成为筛选CRPC-NE患者药物的工具，同时为捕获神经内分泌转分化的驱动基因序列提供全新的视野。
由于缺少CRPC相关的实验模型，研究人员无法对CRPC的生物学和耐药机制有全面的理解和认知。尽管前列腺癌细胞并不少见，但是前列腺癌细胞无论是在活体内还是培养皿内都极难发生增殖。目前只有7条前列腺癌细胞系，然而这些细胞系均无法反映CRPC细胞的异质性：经过长期体外培养后，其肿瘤细胞生物学行为及基因谱表达水平、肿瘤异质性都与原始肿瘤组织存在较大的差异，从而在预测临床药效方面不甚理想。因此需要构建3D类器官系统，通过组织活检细胞和CTC建立适合遗传和药理学研究的长期培养细胞。遗传工程小鼠（GEM）可以提供CRPC疾病进展相关的重要信息，然而这些小鼠模型却依然不能包含所有的肿瘤异质性信息，或者反应肿瘤组织的分层结构。人源性肿瘤异种移植（PDX）是目前与临床关联最多的模型，并且可以反映人源肿瘤的异质性。然而，由于肿瘤组织获取率较低，以及肿瘤组织样本的稀缺，构建PDX模型仍然面临着一定的困难。前列腺PDX大多由局限性前列腺癌或者早期转移性前列腺癌细胞组成。少量的PDX由治疗后的活检样本组成，这种PDX模型往往是用于研究肿瘤内异质性以及在治疗选择压力下的肿瘤克隆进化。
CTC来自原发性肿瘤或肿瘤转移部位，可以在部分前列腺癌患者的血液中发现。CTC检测可以识别CRPC中的癌基因和药物敏感性的生物标志物，是一种非侵入式的液体活检手段。出人意料的是，CTC有潜力提供更加全面的与肿瘤转移相关的分子信息，比起单处转移性病变，CTC可以更好地反应不同转移病灶的肿瘤异质性。由于CTC在少量血液样本中较为稀少，使用诊断性白细胞富集术（DLA，通过连续离心使白细胞从血液中分离出来，从而大量获得患者自体血细胞）可以用于捕获更多的CTC。有研究发现，在免疫功能低下的小鼠中，少数具有肿瘤干细胞特征和致瘤活性的CTC与肿瘤转移进展具有高度相关性。在疾病进展过程中不同时间点从血液中富集分离CTC，使用该CTC衍生的eXplant（CDX）模型可以克服现有模型的局限性，并为探索CTC的致瘤性以及新的靶向策略提供了机会。然而，由于CTC的稀有性和CTC富集技术上的不成熟，CDX的开发仍然具有挑战性。已经有研究建立了用于不同癌种，例如SCLC、NSCLC、黑色素瘤药理学研究的CDX，并且报道了其可行性。还有研究通过建立永久结直肠癌CTC衍生细胞系以及培养用于测试药物反应的乳腺癌细胞，成功实现了CTC的体外扩增。本篇文献中，Fourgeroux团队报导了第一个前列腺癌CDX，该CDX同时具有CRPC的表型和遗传特征。对原发性肿瘤（PT）标本，CTC，CDX和体外CDX衍生细胞系的全面分析，让研究人员可以深入了解CTC致瘤性的遗传基础以及CRPC向CRPC-NE的逐步转化的机制。
首先，研究人员尝试用晚期CRPC患者的血液建立CDX，从15例患者中采集了30个血液样本，并且将造血细胞耗竭片段（hematopoietic blood-cell depleted fraction）植入NSG小鼠体内。被植入小鼠体内的上皮性CTC均通过CellSearch系统处理，血液样本体积为7.5mL，CTC计数范围为0-18389，中位数为230。使用DLA对血浆进行分离后，再利用CellSearch系统对完成分离后的血浆进行处理，植入到NSG小鼠体内的CTC计数范围为0-19988，中位数为698。在将新检测到的CTC重新植入到小鼠体内后的第165天，来自患者3血液的可触及肿瘤在6天内体积增加了一倍（图1-1a）组织切片检查结果显示，前列腺癌患者的原发病灶细胞表型为luminal，然而在CDX中，肿瘤细胞分化程度较低，主要特征为丧失腺体结构（图1-1b）。免疫组织化学染色（IHC）结果显示，在CDX和两例肿瘤组织中，肿瘤细胞上EpCAM和CK8/18为阳性，CK7和Vimentin为阴性。肿瘤组织中PSA和AR表达程度较高，然而CDX肿瘤细胞不表达PSA和AR。 细胞传代至第二代时，CDX肿瘤以及人源肿瘤细胞被贴壁培养于瓶内。CDX衍生细胞在培养瓶内形成贴壁单层和微球形的细胞簇（图1-1c）。细胞培养至第三个月，一部分CDX衍生细胞系被冻存，建立永久细胞系，该细胞系倍增时间为4天。与CDX相似的是，CDX衍生细胞系同样具有神经内分泌标志物相关的细胞表型（图1-1b，d）。有趣的是，CDX衍生细细胞同时也表达瘤干细胞标志物CD133和ALDH。CDX衍生的细胞系在NSG鼠和裸鼠中都具有致瘤性，在植入90至110天之间发展为肿瘤。
表1-1 CRPC患者特点和分离血浆成分
图1-1 CRPC患者特点和分离血浆成分
为了进一步分析CDX细胞表型，研究人员对前列腺癌LNCaP细胞系、CDX、CDX衍生细胞系进行了RNA测序。接着，研究人员分析了250个与CRPC-NE进展相关且出现显著失调的功能基因。这些数据进一步证实了CDX和细胞系组群和转录谱的相似性（图1-2-a）。通过监督分析，比对LNCaP细胞与CDX之间表达有差异的基因后发现，CDX中参与NED与Wnt信号通路的基因显著上调，而参与AR和Notch通路的基因下调（图1-2-b）。与LNCaP相比，与神经发育相关的基因以及CHGA和SYP基因在CDX和CDX衍生的细胞系中过表达（图1-2-c）。同时，STAT3、ASCL1、SOX2 、POU3F2、FOXA2、FOXA1、PDX1、REST 、EZH2 和TIMP-1等转录因子均出现失调，TP53、RB1、PTEN和CYLD等抑癌因子出现下调。
图1-2 CDX和CDX衍生细胞系的转录谱
在纳入研究的8个肿瘤组织样本中，总共检测到205个突变。153（75%）个突变仅出现于一个样本之中，证明了肿瘤组织的高特异度（图1-3-a）。32（16%）个突变在CDX和CDX衍生细胞系中被检测到（图1-3-b，c）。肿瘤组织与CDX细胞之间突变的重合率在5-30%之间（图1-3-d）。这些数据表明，组织活检样本中的肿瘤细胞与CDX和CDX衍生细胞系有着极高相似度。接着，研究人员检测了肿瘤组织、CTC、CDX和CDX衍生细胞系之间共同的拷贝数改变（CNA）。肿瘤组织中仅检测到6个CNA，其中有5个CNA在所有CTC、CDX和细胞系样本中保留（图1-3-e，f）。
图1-3 肿瘤组织、CDX、CDX衍生细胞系的比较基因组分析
基因组分析显示，CTC中25/62（40%）体细胞变异于肿瘤组织同源，35/62（56%）CTC变异与CTC的致瘤性相关，并且也存在于CDX之中。有24/62（39%）的变异共同存在于肿瘤组织、CTC与CDX中，11/62（18%）个变异只存在于CTC和CDX之中（图1-4-a）。这说明携带这些突变的致瘤性CTC可能代表原发性肿瘤中的细胞亚群，或者来自不同的转移病灶部位。52/62（84%）的高置信度变异存在于两个或多个CTC样本中（图1-4-b），37/62（60%）的变异未在原发性肿瘤中发现。经分析检测，CDX中含有80个基因突变，其中32个突变来自于肿瘤组织（图1-5），37个突变只存在于CDX与衍生细胞系，11个突变在只在CTC和CDX中检测到。CDX的基因组分析结果揭示了CRPC-NE中的发生较为频繁的基因组改变，例如TP53突变，TP53、RB1和PTEN丢失，这与基因修饰小鼠模型（GEM）中出现的阿比特龙耐药性和小细胞/神经内分泌表型的肿瘤进展有关。
图1-4 CTC基因组分析
图1-5 CDX以及CDX衍生细胞系的基因组分析
系统发育树显示，CDX和CDX衍生细胞系之间检测到21个躯干改变，包括G279E驱动TP53突变。同时检测到3个CAN，包括TMPRSS2-ERG融合和NKX3.1丢失（图1-5）。检测前列腺癌亚型中CDX基因改变的频率时发现，在前列腺癌亚型细胞中，CRPC-NE和CRPC中分别有54%，43%和26%的基因改变，发现了躯干突变和融合（图1-7a）。携带分支突变的基因在CRPC-NE中出现改变的频率是前列腺癌的三倍。
图1-6 CDX和CDX衍生细胞系的系统发生关系
图1-7 前列腺癌亚型细胞中CDX基因变化的频率
为了进一步验证CDX可以用于评估CRPC相关的临床药物疗效、为个体化治疗提供实验模型，研究人员检测了CDX对多西他赛、恩杂鲁胺、奥拉帕利的敏感度。给未接受去势治疗的小鼠体内植入CDX肿瘤细胞后，分别再往小鼠体内注射多西他赛、恩杂鲁胺、奥拉帕利等化疗药物。同时取一组未接受去势手术的小鼠作为对照组，注入同样剂量的化疗药物，比对不同组别小鼠的肿瘤生长情况。在接受三种药物后，CDX和对照组之间的细胞生长情况并未出现显著差异，CDX成功模拟了标准CRPC治疗中出现的多西他赛和恩杂鲁胺耐药状况。由于无双等位基因缺失，CDX也对奥拉帕利产生耐药（图1-8）。这与PAC120异种移植模型（xenograft）结果完全不同，该模型在过去的研究中被报道对多西他赛和恩杂鲁胺敏感。同时，CDX衍生细胞系也对多西他赛和恩杂鲁胺有抗药性（图1-9）。总而言之，CDX模型体内、体外的药物检测均忠实地概括了患者对多西他赛和恩杂鲁胺治疗的反应。
图1-8 体内药物测定
图1-9 体外药物测定
该研究在转移性前列腺癌活检样本、临床相关实验模型稀缺的情况下，为发展构建新的肿瘤模型开辟了美好的前景。虽然有越来越多的研究者认为谱系可塑性是治疗耐药性的潜在机制，但该研究结果表明，CRPC疾病进展和分化为CRPC-NE的过程促使CTC获得致瘤性，同时使CTC获得CRPC-NE相关的特点。CDX模型可能是一种独特的工具，可以提高研究者们对CRPC转化为CRPC-NE的遗传与表观遗传机制的理解，以及可能逆转或延迟这一过程的治疗方法。
DNA methylome profiling of circulating tumor cells in lung cancer at
single base-pair resolution
单碱基对分辨率下的肺癌循环肿瘤细胞DNA甲基化图谱
发表时间：2021年3月
发表期刊：Oncogene
徐州医科大学Dong带领的团队通过LCM-uWGBS技术对CTC内DNA进行了单碱基对分辨率的甲基化分析，对肺癌患者的CTC DNA甲基化组学有了新的认知。该研究团队的通过全面分析CTC的表观遗传状态，阐明了肿瘤细胞散发和转移机制，为未来开发新的肿瘤生物标志物开拓了更美好的前景。相关结果近日发表在著名期刊《Oncogene》上。
摘要
DNA甲基化在肿瘤细胞的调节中起着关键作用，DNA甲基化出现异常是肿瘤发生的一个重要信号。由于缺少相应的检测和分析手段，CTC的DNA甲基化组学尚未明确。激光捕获显微切割联合甲基化测序（LCM-uWGBS）可以高效微切割CTC样本，进行CTC的DNA甲基化测序。LCM-uWGBS通过对捕获的CTC进行全基因组重亚硫酸盐测序，帮助研究人员进一步了解CTC内甲基化图谱。该研究分析了肺癌患者CTC的甲基化组。从CTC甲基化组的全面分析结果中可得知，CTC中的DNA甲基化特征与肺癌患者的肿瘤组织不同。进一步分析表明，上皮细胞基因的启动子高甲基化是癌细胞进行上皮-间质转化（EMT）的标志。此外，CTC在系统中播散和转移过程中有可能被赋予了干细胞特征。这一发现促使了研究者对CTC进行单碱基对分辨率的DNA甲基化分析，这可能有助于寻找可以辅助临床诊断的CTC DNA甲基化生物标志物的相关研究。
循环肿瘤细胞是从原发或转移病灶上脱落下来的肿瘤细胞。CTC一旦进入血液循环，就有可能形成远端转移，最终导致患者死亡。CTC的数量与诊断和临床疗效的相关性已经得到了很多研究的验证，CTC在肿瘤的诊断和监控方面也得到了广泛的应用。此外，被捕获的CTC中含有完整的癌细胞遗传和转录信息，适用于临床标记物的开发。目前主流的CTC分离技术为显微操作法（micromanipulation），即采用微吸管，在荧光显微镜下操作，吸出单个循环肿瘤细胞；然而，该方法耗时较长且步骤繁琐。激光捕获显微切割（LCM）已经被广泛地运用于分离肿瘤组织上的细胞，尤其是福尔马林固定和石蜡包埋的样本。LCM同样可以运用于从白细胞中分离CTC，并且已经成功地被使用于分离CTC单细胞。使用LCM分离CTC可以保证细胞完整度，使得下游CTC基因测序可以更好地开展。
DNA甲基化是细胞用于控制基因表达的表观遗传机制。已经有大量的研究探索了DNA甲基化在癌症中的作用，甲基化异常会导致基因调控变化，启动癌基因。了解表观遗传变化有望改善恶性肿瘤的表征，辅助肿瘤诊断和预后。一些特定的癌种中DNA甲基化会出现变化。随着高通量技术的出现，如DNA甲基化芯片和全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），已经生成了大量的DNA甲基化分析数据。这些数据已经为研究者在肿瘤的诊断以及预后提供了宝贵的信息。目前，由于CTC分离技术以及在稀有细胞内进行DNA甲基化测序均具有挑战性，CTC DNA甲基化的研究少之又少。已有一些开创性的研究探索了特定基因的DNA甲基化。Chimonidou等人研究了乳腺癌CTC中三个肿瘤相关基因（CST6，BRMS1和SOX17）的甲基化状态。该研究结果表明，DNA甲基化的调节会影响这些基因表达情况。
CTC的表观遗传图谱仍然是具有巨大潜力的未开发领域。越来越多的研究证实了表观遗传学的重要作用，尤其在几种细胞机制中的DNA甲基化对表观遗传学的影响，阐明CTCs的DNA甲基化谱对于了解肿瘤转移的分子机制至关重要。该项研究中，研究人员试图以单碱基对分辨率更好地了解CTC的全基因组DNA甲基组。LCM用于CTC分离，WGBS用于分析肺癌患者CTC DNA甲基化数据。通过全面分析CTC的表观遗传状态，更深入地阐明播肿瘤传播和转移过程中的机制和开发肿瘤生物标志物。
该研究通过免疫荧光染色和染色体荧光原位杂交鉴别CTC。CTC的特征是具有上皮细胞标志物和/或染色体超二倍体的有核细胞，没有淋巴细胞标志物CD45。为了避免受EpCAM下调或者不表达造成的干扰，本次研究辨别CTC的方法为DAPI+/CD45-/CEP8>2（图2-1）。接着使用激光捕获显微切割（LCM）在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜包被载玻片上捕获CTC。为了使CTC很容易被LCM分离并与下游分析兼容，CTC样品被封装在水凝胶基质中。μWGBS是一种基于重亚硫酸盐处理后接头标记技术（PBAT）测定的少数细胞的成熟DNA甲基化分析方法。为了稳健有效地鉴定CTC的全基因组DNA甲基化谱，研究人员通过联合LCM的CTC捕获分离技术和μWGBS开发了LCM-μWGBS检测CTC DNA甲基化工作流程。
图2-1 LCM-uWGBS检测CTC DNA甲基化基本流程图
为了验证这一技术的可行性，研究人员用LCM-μWGBS检测了A549细胞系的DNA甲基组，并将其与已有的人类A549细胞系WGBS数据进行了比对。使用LCM从混合血细胞中分离出10个和50个A549细胞的实验组。将每个样品中分离出的细胞汇集在一起，为随后的μWGBS提供足够的起始材料。结果表明，10细胞和50细胞A549 DNA甲基组的亚硫酸氢盐处理转化率超过98%，表明该方法的保真度较高。在A549细胞系中10细胞组和50细胞组的DNA甲基组中分别检测出16660129和19437132个CpG位点，占全基因组水平总CpG位点的58%和61%（图2-2-a）。接着比对了启动子区域，10细胞组和50细胞组的Pearson相关系数分别为0.91和0.94（图2-2-b）。此外，这两个数据显示的DNA甲基化水平与A549细胞系WGBS数据相似。该结果表明LCM-μWGBS提供了准确高效的CTC DNA全基因组甲基化信息。
图2-2 LCM–μWGBS 的可重复性和稳定性
本次研究纳入了15例肺癌患者，提取出的CTC数量为10-22个CTC/5mL血液。为了对CTC播散和转移过程中的DNA甲基化变化有更全面的了解，研究人员使用LCM–μWGBS对15个CTC样品，5个肿瘤样本和5个肺癌患者正常组织样本进行了全基因组DNA甲基化分析（图2-3）。为了评估CTC样品之间DNA甲基化的相似程度，研究人员计算了每两个样品之间的Pearson相关系数。平均相关系数为0.68，表明CTC样品的一致性相对较高。进一步的Hierarchical clustering分析表明，CTC之间的相似度比CTC和原发肿瘤的相似度更高。有大量研究报道健康组织的CpG甲基化程度（70-80%）比肿瘤组织高。本次研究发现，CTC的全基因组DNA甲基化程度比健康组织和肿瘤组织都低。从健康组织、肿瘤组织再到CTC，甲基化程度逐级递减，这说明在肿瘤进展的过程中DNA甲基化持续丢失。进一步分析表明，相邻CpG位点和甲基化水平之间的关联显著丧失，表明DNA甲基化丢失可能是随机的，而不是只发生在连续的CpG位点。从基因组学的角度来看，DNA甲基化丢失可以发生在基因序列上的任何区域，如启动子、基因体、内含子和基因间隔区。根据CpG的含量对启动子进行分组后，与原发肿瘤样本比对时，CTC DNA在CpG较少的的启动子处含有更多的未甲基化的CpG，在CpG岛启动子上则表现出于肿瘤样本相似的甲基化CpG。这表明CTC中低甲基化的CpG位点主要发生在缺乏CpG岛的启动子区域。
图2-3 肺癌CTC DNA全基因组甲基化变化
研究人员通过检测差异性甲基化区域（DMR），以更深入地研究CTC和原发性肺癌DNA甲基组之间的差异。研究人员总共辨认出64607个CTC和肿瘤组织之间的DMR（ctc-DMR），28414个肿瘤组织和健康组织之间的DMR（t-DMR）。其中有3292个DMR之间互相重合（图2-4）。43283（67.0%）个ctc-DMR甲基化程度较低，在CTCs甲基化异常位点处，DNA甲基化倾向降低。同时，DNA低甲基化区域中显著富集了几个转录因子结合位点（TFBS），这些区域对CTC具有特异性。例如，转录因子EGR1在CTC低甲基化区域显示出最显着的富集。尽管DNA甲基化随着在肿瘤发展过程中逐步丢失，但研究人员也发现t-DMR中的高甲基化CpG位点在CTC中获得了更高的甲基化。在肿瘤中，高甲基化的几种抑癌基因启动子在CTC中具有更高的甲基化趋势，并具有潜在的癌症驱动作用。
图2-4 差异甲基化区基本特征
先前的研究已经证明，CTC经常处于上皮-间质转化过程（EMT），导致上皮细胞抗原显著丢失。不同的上皮和间充质化基因在EMT过程中具有协同作用，因此研究人员全面检查了CTC上皮和间充质标记物的表观遗传状态。如图2-5所示，上皮细胞基因启动子在CTC样品中被高甲基化。这一结果与先前的结论一致：CTC失去部分上皮特征，同时上皮基因的启动子高甲基化是EMT过程的标志。干细胞基因的启动子在CTC（如ALDH1A1，CD44）中被低甲基化，这极大地支持了TFBS富集分析提出的研究结果，进一步表明CTC被赋予了与干细胞相关的特征。该结果可能在CTC转移能力的研究中起关键作用。
图2-5 上皮细胞、间质细胞、干细胞标志物DNA甲基化程度
综上所述，该研究团队为CTC DNA甲基化分析提供了一种强大而有效的方法。通过使用LCM-μWGBS，研究人员详细描绘了单碱基对分辨率下肺癌CTC中DNA甲基化图谱。这一研究可能有助于寻找能用于临床诊断的CTC DNA甲基化生物标志物。
Circulating Tumor Cell Number as a Response Measure of Prolonged Survival for Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer： A Comparison With Prostate-Specific Antigen Across Five Randomized Phase III Clinical Trials
循环肿瘤细胞计数作为转移性去势抵抗性前列腺癌延长生存期的反应指标：与五项随机 III 期临床试验中前列腺特异性抗原的比较
发表时间：2018年2月
发表期刊：Journal of Clinical Oncology
斯隆—凯特林癌症研究所的Glenn Heller团队在知名国际期刊《Journal of Clinical Oncology》上发表的研究成果展现了在治疗前后对循环肿瘤细胞（CTC）进行动态监测的重要性。通过观察CTC数量在基线和治疗后的变化，可以更准确地判断患者的总生存期。
目的：在转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）临床研究和实践中，目前的技术仍无法及时检测患者体内早期发生且具有临床意义的反应。研究人员在长达13周的五项前瞻性随机III期试验中探索了循环肿瘤细胞（CTC）和前列腺特异性抗原（PSA）反应终点，该临床试验共纳入了6081例患者。
方法：该研究中共探索了8个反应终点。CTC0：基线时CTC数量大于0，第13周时CTC数量为0；CTC转化点：基线时CTC数量≥5，13周时CTC数量≤4；CTC计数减少30%、50%、70%；PSA水平下降30%、50%、70%。缺少第13周各方面检测数值的患者被视为无反应者。研究者使用weighted c-index评估了每项试验终点相对于总生存期的的判别优势（discriminatory strength）。
结果：在八个反应点中，CTC0和CTC转换点具有最高的weighted c-index，标准偏差较小。CTC0平均值（标准偏差）为0.81（0.04）；对CTC转换点平均值为0.79（0.03）；CTC计数减少30%反应点平均值为0.72（0.06）；CTC计数减少50%反应点平均值为0.72（0.06）；CTC计数减少70%反应点平均值为0.73（0.05）；PSA水平下降30%反应点平均值为0.71（0.03）；PSA水平下降50%反应点为0.72（0.06）；PSA水平下降70%反应点则为0.74（0.05）。75%的符合条件的患者可以通过CTC0进行评估，51%的患者可以通过CTC转化点进行评估。
结论：CTC0和CTC转换点对mCRPC患者总生存期的判别力最高。两者都是稳定且有意义的反应终点。CTC0适用于的患者比例比CTC转换点更高。
转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的治疗前景得到巨大的改善。自2010年以来，FDA已经批准了六种具有不同作用机制的新疗法。所有疗法都被大规模III期试验生存获益结果证明有效。在过去，与mCRPC相关的实验都以研究PSA的变化为主：例如通过观察某一时间点的PSA的最大值，判断患者治疗疗效。然而前列腺特异性抗原（PSA）的占比并不能作为一个优秀的生存率（OS）标志物。其他反应终点也具有一定的问题。例检测骨转移时，较难通过影像学结果判断早期的变化代表疾病恶化还是疾病改善。RECIST标准也可以用于评估可测量疾病的变化，但是该标准被使用的次数较少。随着越来越多的疗法的出现，研究者们更加紧迫地需要能可靠地反映OS的反应指标。
大多数肿瘤通过血液传播单细胞或者细胞簇的形式转移。目前，已大量的设备和检测方法可以检测、计数和分析循环肿瘤细胞（CTC）的生物学特征，并且已经被运用于不同癌种的临床治疗之中。已有mCRPC相关的研究表明，与淋巴结疾病相比，骨病患者检测到的CTC数量更高，并且与疾病负担的相关性不大。这表明肿瘤细胞具有分离、在血液中循环、存活和转移至远距离器官的能力。因此，抑制肿瘤细胞通过循环系统扩散是具有临床意义的。
在阿比特龙和恩杂鲁胺的三项II期研究中证明了CTC转化率在35%至40%之间后，该研究团队开始与美国FDA疾病和放射健康中心合作，研究治疗后的CTC作为生存期的可替代标志物。在这项研究中，我研究者比较了CTC数量和PSA反映接受治疗后mCRPC患者的生存率的能力。研究者分析了过去6年内完成的五项独立随机临床试验的数据，这些临床试验招募了mCRPC患者的不同人群，包括接受过化疗以及接受过一种或两种延长寿命疗法的治疗失败者。如果可以找到一个强有力的长期生存期指标，便可以在早期临床试验中使用CTC终点，加速药物开发。
被纳入试验的患者为6081例，表1为实验概要。表2总结了每个试验中患者的基线和13周时的CTC和PSA数据。这些总结均具有显著的异质性。CTC和PSA的基线和在13周的数量被用于定义该实验的反应终点。每项试验的可评估研究队列是具有CTC基线或PSA值且存活至少13周的患者。该试验中，八项CTC和PSA反应测量点为：CTC0（CTC基线>1，第13周为0的患者）；CTC转换点（CTCconv；CTC基线≥5，第13周≤4的患者）；CTC的百分比变化（CTC30，CTC50，CTC70；CTC计数≥基线时为5，从基线到第13周分别下降了30%，50%或70%）；PSA的变化百分比（PSA30，PSA50，PSA70；PSA基线水平≥5 ng / mL，从基线到第13周分别下降了30%，50%或70%）。达到这些生物标志物阈值的患者被记录为反应者，其他患者都被记录为无反应者（包括基线数据被记录且存活超过13周，但在第13周之前退出了研究的患者）。
值得注意的是，在COMET-1中，CTC和PSA值的基线最高。该临床试验招募了同时接受了至少两种批准的延长生命的疗法（紫杉烷化疗和阿比特龙或恩杂鲁胺）后出现疾病进展的患者。ELM-PC-4中，CTC和PSA值的基线最低。该试验招募了之前没有接受过任何mCRPC延长寿命治疗的患者。
表1 转移性去势抵抗性前列腺癌III期研究的相关分析数据
表2 PSA与CTC中位数
每项研究的患者评估流程如表3-1、图3-1所示。每个试验中具有合格CTC数据的患者百分比差异很大。例如，在ELM-PC-4临床试验中，1560名随机分配的患者中有1288名（83%）患者具有CTC基线数据，并且存活至少13周。在1288名患者中，848名（66%）的基线CTC值大于0并且适用于CTC0响应终结点的评估。适用于CTC转化率和CTC反应终点的百分比变化需要基线CTC≥5的患者，ELM-PC-4只有497名患者（39%）符合。
图3-1 五项随机临床试验的CONSORT报告声明
表3-3和图3-2使用weighted c-index指数展现了CTC和PSA响应终点判断总生存率的强度。图3-2所示，水平轴列出了所研究的八个端点，垂直轴为weighted c-index。每个临床试验都由一个字母（A到E）表示；字母的大小与其所代表的研究中weighted c-index的SE成反比，较大的字母表示更准确的判别能力。CTC0和CTC转换点最适合在第13周时判断患者的生存结果。治疗后未检测出CTC，或CTC值从高于阈值（≥5）转换为低于阈值，与CTC或PSA反应终点的百分比变化相比，对患者生存率的判别能力更高。CTC0与CTC转换点的weighted c-index平均值分别为0.81和0.79（表3-3），然而CTC百分比变化与PSA反应终点则为0.71和0.74。除了对生存率的辨别能力更高之外，CTC0和CTC转换点更稳定，在五项临床试验中产生的weighted c-indices保持一致。表3-3中较小的标准偏差和图2中更紧密的字母聚类均证明了CTC0与CTC转换点的稳定性。
图3-2 治疗后CTC和PSA反应情况在mCRPC注册试验中对生存率的判别能力（discriminatory power）
表3-3 Weighted C-Index以及标志物反应终点
为了进一步解释weighted c-index的大小如何表明响应终点和生存终点之间的关系，研究者为每项试验生成了Kaplan-Meier生存模型（图3-3），用于预测治疗反应者和无反应者的生存率，以及相对应的weighted c-index。ELM-PC-5试验的Kaplan-Meier模型（图3C）的检查清楚地描述了CTC0反应者相对于CTC0无反应者具有更好的生存状况，这也体现于weighted c-index的数据（0.83）中。与其相反的是，PSA50反应者与无反应者之间的生存率的差异相对较小，该结果与其weighted c-index一致（0.74）。CTC0和PSA50之间的判别差很小，因为weighted c-indexes分别为0.78和0.76。
图3-3 五项mCPCR试验中应答者与无应答者Kaplan-Meier生存曲线
总结：
开发新的药物前，研究者首先需要具有判断该治疗药物是否具有带来临床益处（例如，改善患者的感觉、生活能力以及生存时间）的能力。然而，在mCRPC的研究中，这种看似简单的需求却一直是药物开发中最具挑战性的方面之一，因为研究者们缺乏可靠且能提供大量信息的早期临床指标。治疗后通过检测PSA变化判断预后的方式不够可靠。该研究通过数据分析，定义了CTC0终点。CTC0是CTC数量从可检测（存在）到不可检测（不存在）的变化，是一种可以反应治疗疗效的生物标志物。同时，CTC0与患者的生存期密切相关，可以为患者带来临床益处。
晶准医学成立于2018年，落户大湾区，坐落于深圳坪山海科兴战略新兴产业园和香港科学园，是一家集精准医疗液体活检技术研发、产品转化、生产、销售以及检测服务为一体的国家高新技术企业。公司拥有国际先进、自主知识产权的微流控技术与核酸检测技术，为肿瘤液体活检提供全方位的精准诊断产品、方案以及服务。晶准医学在全国范围内率先推出“全方位肿瘤液体活检整体解决方案”，致力于提供高效和精准的个体化肿瘤液体活检检测产品和服务，实现肿瘤早诊早筛、精准诊断与实时监测。
公司技术力量雄厚，在国内外数位院士的带领和指导下，拥有数十位博士和硕士为主体的研发团队，开展多项与肿瘤液体活检技术相关的科学研究与产品开发。公司核心技术“微流控芯片上的细胞操控与检测技术平台”荣获2015年国家教育部自然科学二等奖、2016年药明康德生命化学奖、2019年亚洲国际创新大奖（金奖）以及第47届日内瓦国际发明展金奖，并在国际知名杂志上发表相关论文数十篇，拥有多项发明专利。公司曾作为粤港合作典范，受到了国家领导人习近平的关注并参观了研发实验室。由于公司发展迅速，更是被德勤评为2019《香港明日之星企业（Hong Kong Rising Star）》，且连续两届被评为粤港澳大湾区生物科技创新企业50强先锋企业。
公司拥有近3000平米的生产厂房，建有万级洁净车间、十万级洁净车间、PCR实验室及晶益医学检验实验室。严格按照国家药品质量管理体系（GMP）、医疗器械质量管理体系（YYT0287/IS013485）、欧盟生产质量标准（CE）建立了完善的肿瘤液体活检所需的研发、生产及检测服务体系。
晶准医学产品系列
一、晶准医学自主研发的首款CTC100循环肿瘤细胞分选仪已于2019年7月获国家药品监督管理局批准上市，具有高效便捷、灵敏特异、样本需求少、应用广泛的特点，全面领先目前市面上的同类产品。该设备已为临床提供CTC计数与分型信息，免疫治疗靶向蛋白检测以及用药靶点基因检测等信息，可拓展应用于全基因组测序、体外培养及药敏评估等，为肿瘤早期筛查、预后判断、伴随诊断、复发预警、疗效监测等提供精准信息。
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项目依托近20年研发积累的先进微流控技术和核酸检测技术，提供全方位肿瘤液体活检整体解决方案应用于肿瘤诊断全程管理，包括早诊早筛、辅助诊断、用药指导、实时监测等领域，利用微流控技术建立高效多功能的CTC检测与研究平台；利用核酸检测技术，高灵敏、高特异性地检测与肿瘤诊断相关的DNA与RNA信息，为肿瘤诊断提供精准的多样化临床信息。
晶准医学荣誉
▪2015年教育部自然科学二等奖
▪2016年获药明康德生命化学奖
▪2019年日内瓦国际发明展（金奖）
▪2019年亚洲国际创新大奖（金奖）
▪2019年21届中国国际高交会优秀产品奖
▪2019年深圳市创新创业大赛决赛
▪2019年工信部国际创新创业大赛香港季军
▪2019年第八届中国创新创业大赛行业总决赛
▪2019年德勤《香港明日之星企业 （Hong Kong Rising Star） 》
▪2020年第三届粤港澳大湾区生物科技创新企业50强——“先锋企业”
▪2021年第四届粤港澳大湾区生物科技创新企业50强——“先锋企业”和“最受欢迎企业”
