2022年第八期·肿瘤液体活检临床学术文献汇编
间质转化受限的上皮型系统性乳腺癌细胞是发生转移的主要来源 1
通过单细胞RNA测序剖析肝细胞癌的空间异质性和免疫侵袭机制 10
循环肿瘤细胞的检测及其作为肝细胞癌诊断、预后和治疗监测生物标志物的意义 20
Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with a restricted mesenchymal transition are a major source of metastasis
间质转化受限的上皮型系统性乳腺癌细胞是发生转移的主要来源
发表时间：2019年5月
发表期刊：Science Advances
来自上海交通大学的Hongxia Wang团队研究了上皮-间质转化（EMT）对乳腺癌（MBC）疾病进展的作用。团队在BALB/c小鼠模型中揭示了CTC在个体间和个体内具有异质性，其中间质转化受限的上皮型CTC（E/m型）具有强大的肺转移能力，这伴随着他们迁移性，非贴壁依赖的细胞生长的侵袭力的增强。团队还通过CTC单细胞测序证明了EpCAM表达与CTC表型具有相关性，EpCAM+ DTC的细胞黏附、增殖和上皮分化能力增强，可作为MBC临床样本的标志物，并进一步发现EpCAM+ DTC的比例可用于预测MBC患者的转移状态与临床结局。
癌细胞会发生上皮-间质转化（EMT）；然而，EMT的异质性对疾病进展的贡献仍然是一个有争议的话题。在这里，我们阐明了在转移性乳腺癌（MBC）同源小鼠模型中离体培养的循环肿瘤细胞（CTC）和播散性肿瘤细胞（DTC）的EMT状态。限制性间质转化的上皮型CTC具有最强的肺转移能力，而间质型CTC的转移能力则有限。EpCAM作为替代标志物，用于评价MBC临床样本EMT的异质性，包括转移癌、CTC和DTC。上皮型CTC，尤其是DTC的比例与MBC患者的远端转移和较差的预后相关。这项研究加深了对转移过程中EMT的理解，并支持了EMT表型异质性作为肿瘤预后和治疗的重要参考。我们进一步表明，依赖于EpCAM的CTC分离富集系统将低估CTC的数量，但会定量临床相关的转移癌细胞。
在这项研究中，研究人员在MBC小鼠模型中将CTC和DTC的EMT表型与肺转移能力相关联，并定义了一种具有混合表型的全身性肿瘤细胞群体，作为此模型中最具有侵袭性的细胞类型：它主要为上皮型，且具有中度向间质转化特征（E/m型）。4T1来自于BALB/c小鼠410细胞系，是一种具有6-硫鸟嘌呤（6-TG）耐药性的MBC小鼠细胞，在植入免疫功能正常的BALB/c小鼠后会形成肿瘤并自发转移，这种特征非常接近于人类乳腺癌IV期的表现。在本研究中，团队选用4T1 MBC小鼠模型来分析EMT对体内外功能的影响。首先将4T1细胞通过皮下移植在BALB/c小鼠的侧腹部位，并在一段时间后处死小鼠并收集原发肿瘤，血液，骨骼和器官，并通过6-TG来恢复4T1细胞（图1-1A）。来自血液的4T1细胞系（CTC1）和来自骨髓的4T1细胞系（DTC1）与4T1差异巨大，亲本4T1细胞显示出典型的上皮表型（E型），其细胞之间紧密接触；CTC1显示出间质表型（M型），其细胞之间黏附力丧失；DTC1则保持了杂交表型，大多数DTC1保留了上皮表型，但仍有少量间质表型亚群（图1-1B）。免疫组化染色（IHC）显示4T1和DTC1有较高水平的EpCAM、上皮钙粘蛋白（E-cadherin）表达，而CTC1则没有（图1-1C）。为了证实CTC1确实没有EpCAM的表达，该团队补充了流式细胞仪的分析结果，EpCAM表达量依据其平均荧光强度来计算，并体现在黑色的直方图中，结果证实CTC1细胞中EpCAM的表达完全丧失，除此之外，EpCAM在DTC1中的整体表达相比其亲本4T1减少了约50%（图1-1D）。团队接着评估了4T1，CTC1和DTC1中部分上皮标志物和间质标志物的mRNA水平，结果显示CTC1中上皮标志物EpCAM，E-cadherin，Rab25和Grhl2显著降低，而间质标志物N-cadherin，Vimentin，Slug，Zeb1和Zeb2则显著增加（图1-1E）。
在确定了4T1，CTC1和DTC1表型差异后，团队开始研究EMT表型与肿瘤细胞的行为和功能之间的联系。团队首先对经过5天细胞培养的培养物中的代谢水平和细胞数量进行评估，结果显示4T1具有最高的细胞代谢水平，接下来是DTC1，最后是CTC1（图1-1F）。使用3D软琼脂评估4T1，CTC1和DTC1的非贴壁依赖性生长情况，相比较4T1，CTC1细胞群具有大幅度增强的非贴壁依赖性细胞生长，而DTC1只有轻微的提升（图1-1G）。团队还评估了4T1，CTC1和DTC1在体内对小鼠内皮细胞、基质胶和明胶的黏附作用，DTC1对内皮细胞的粘附率高于4T1，随后是CTC1（图1-1H）。在伤口愈合实验中进行的细胞迁移实验显示，相比4T1，CTC1和DTC1的迁移能力分别提升至2.3倍和1.9倍（图1-1I）。在基质胶包被的Boyden腔室测试中，CTC1有最高的侵袭能力，随后是DTC1，最后是4T1（图1-1J）。这些结果表明，CTC1的增殖和粘附性减少，但迁移性，非贴壁依赖性细胞生长和侵袭能力增强；DTC1则在整体上得到提升，包括保留了一定程度的增殖，略微提升了非贴壁依赖性细胞生长，增强的粘附性、迁移和侵袭能力。
图1-1 4T1 MBC小鼠模型中全身性癌细胞的EMT表型和体外功能特性
团队在小鼠模型中验证了三种细胞系的致瘤能力，在接入相同数量的4T1，CTC1和DTC1（1.25×105）到BALB/c小鼠侧腹皮下组织后3周后发现，DTC1移植小鼠肿瘤的平均重量和大小最高，且成瘤率100%（n=8）；4T1移植的小鼠虽然均成瘤，但肿瘤重量相比DTC1显著降低；CTC1只有41.2%的成瘤率（7/17），且具有最低的平均肿瘤重量（图1-2A）。为了进一步分析CTC1的成瘤能力，团队在皮下注射了过量的CTC1，发现8倍和16倍剂量的CTC1才能达到4T1和DTC1诱导形成的肿瘤重量和大小（图1-2B）。针对三种细胞系皮下转移能力的结果显示，4T1和DTC1具有相同的转移率（80%），而CTC1则在注射了超量的细胞（2×106）后才达到80%的成瘤率（图1-2C）。因此，与4T1和DTC1相比，单个CTC1具有显著降低的致瘤和转移能力。
接下来，通过DTC细胞的皮下移植，研究人员从其中四只小鼠的血液中分出26个CTC亚系，其中两只小鼠骨髓中建立10个DTC亚系。图1-2D显示了CTC亚系从上皮到间质的表型转化过程。在E，E/m，M/e和M型细胞亚群中均能够观察到表型异质性，且他们不仅来自不同小鼠的CTC亚系，还可以来自同一只小鼠（图1-2E），这表明在单独的小鼠血液中存在具有不同EMT表型的CTC。对不同表型CTC进行IHC染色发现M/e型CTC的EpCAM和E-cadherin表达量较低，而大多数E/m型CTC则具有较高的EpCAM和E-cadherin表达（图1-2F）。在E/m型CTC中也观察到了更高的代谢和增殖速率（图1-2G），对内皮细胞、基质胶和明胶更高的粘附性（图1-2H）以及入侵能力方面显著但非常轻微的增加（图1-2I）。
为了研究三种细胞系在血液中发生肺转移的能力，团队将E型细胞（4T1），E/m型细胞（CTC6-6，CTC6-11，CTC8-1），M/e型细胞（CTC8-6，CTC8-5，CTC8-1）和M型细胞（CTC1）以同样的数量（5×104）接入BALB/c小鼠的静脉（图1-3A）。并在19天后对表面转移进行计数和体外转移群落形成测试，结果表明，与M和M/e型细胞相比，E和E/m型细胞具有增强的转移能力，混合表型（E/m型）CTC细胞系表现出最高的转移能力（图1-3B）。为了验证转移指数的差异是由于M/e型CTC发生肺转移的潜伏时间长，而不是固有的转移能力降低，团队在小鼠临近生命终点时处死并检查肺转移的情况，结果显示，在九只CTC8-1（n=4）和CTC8-5（n=5）小鼠中，两只显示出严重的肺转移（22.2%）；四只在较大的骨骼附近有转移（44.4%）；三只有多个肿瘤位点（33.3%）（图1-3C），CTC8-6（n=5）注射的小鼠没有严重的肺转移，五只小鼠全部发生大骨骼附近转移，其中三只产生多个肿瘤位点（图1-3D）。图1-3E描述了浅表肺转移灶的数量、转移群落和每个注射细胞的相应转移指数，并证实了E/m型CTC6-6转移指数较高。
团队通过分析EpCAM表达与EMT表型的相关性，判断EpCAM能否作为MBC临床样本的替代标志物。通过流式细胞术在4T1衍生的细胞系中定量EpCAM的表达，结果显示，从骨髓中再培养的DTC和从器官转移物中再培养的亚系均表达更高的EpCAM，并且从DTC1小鼠血液分离的CTC亚系，具有显著异质的EpCAM表达（图1-4A）。在Spearman相关性分析中，EpCAM的高表达与较高的EMT评分呈负相关（r = −0.728, P < 0.001）（图1-4B）。因此，EpCAM的表达在原发性和全身性的4T1亚细胞系中的表达具有异质性，CTC中EpCAM的高表达与上皮表型的保留有关，在单个动物体内，血液CTC的EMT也具有高度异质性。
图1-2 4T1、CTC1和DTC1的体内致瘤性和源自DTC1的CTC细胞系的EMT特征
图1-3 4T1、CTC1、DTC1移植动物的转移发生情况
图1-4 EpCAM表达与上皮型细胞和人类CTC具有相关性
研究人员进一步探究了EMT异质性以及EpCAM表达与CTC上皮型的相关性能否在MBC患者中得到观察，他们从MBC患者身上收集了原发性肿瘤和相应的淋巴结转移（n=12），肝转移（n=10），肺转移（n=8）和骨转移（n=8）组织，并对EpCAM进行IHC染色，结果显示，EpCAM在转移瘤中的表达更高（图1-4C），这也进一步验证了4T1 MBC小鼠模型的结果。团队还对CTC进行单细胞DNA测序，检测EpCAM+（n=10）和EpCAM-（n=20）CTC中全基因组拷贝数变异（CNV），并在能够区分出EpCAM+的CNV中使用GO富集分析受影响基因的潜在功能，发现与紧密连接（CLDN3，STRN和PTPN13）、有丝分裂细胞周期（CCNB1，SHB，EIF4EBP1，DUSP3和ABL1）、乳腺上皮细胞分化（ERBB4）和乳腺导管形态发生（GLI2和CSF1R）相关的基因得到了扩增，表明EpCAM+ CTC的细胞黏附，增殖和上皮分化的能力增加（图1-4D）。
图1-5 EpCAM+全身性肿瘤细胞的比例与MBC患者的临床结局相关
研究人员最后评估了EpCAM的表达是否与MBC患者转移状态和疾病结果相关。图1-5A描述了单个/集群CTC和DTC代表性的SE-iFISH结果。在34个病人中共分离出845个CTC和71910个DTC，图1-5B（top）展示了每个患者CTC和DTC数量的关联，与血液相比，骨髓中的细胞集群数量更高（图1-5B middle），EpCAM+ DTC的比例（65.9%）比EpCAM+ CTC的比例（22.4%）更高（图1-5B bottom），34例患者中，20例（58.8%）血液中没有可检测的EpCAM+ CTC；12例（35.3%）骨髓中没有可检测的EpCAM+ DTC（图1-5C）。临床结果表明CTC和DTC的高比例与可检测的器官转移呈正相关性，且高比例的EpCAM+ DTC与肺转移的发生显著相关（图1-5D）。对所有患者中位随访11个月，并应用受试者工作特征曲线（ROC）来确定EpCAM+ DTC的比例在6个月生存期中的敏感性和特异性，结果显示EpCAM+ DTC的比例能够准确预测MBC患者6个月死亡风险（AUC：0.785，CI：0.588-0.983，P = 0.018）（图1-5E），其中EpCAM+ DTC比例大于20%的患者显示出总体生存期的严重下降（图1-5F），在排除了EpCAM二倍体CTC和DTC后，EpCAM+ CTC和DTC的比例分别下降到6.3%和56.9%。EpcAM+非整倍体CTC和DTC的比例与远端和肺转移相关（图1-5H），此外，EpCAM+非整倍体DTC的比例准确预测了MBC患者6个月的死亡风险（AUC：0.793，CI：0.599-0.988，P = 0.015）（图1-5I）。EpCAM+非整倍体DTC比例大于15%的患者显示出总生存期的严重下降（图1-5J）。
总结
这项研究利用MBC小鼠模型来理解EMT在癌症转移中的作用，以准确概括MBC的临床情况。团队在MBC小鼠模型和III期和IV期MBC患者的临床队列中证实，具有混合E/m表型的CTC极大地促进了结果限制性转移的形成，且EpCAM+的DTC可以准确预测6个月的生存期和总生存期。另外，由于在EMT转化过程中CTC容易丢失EpCAM，因而依赖EpCAM的CTC富集方法（如CellSearch）将低估CTC的数量。对CTC和DTC的数量进行定量并根据其EMT表型细分全身性肿瘤细胞，对改善转移风险的预测，并支持治疗决策是有益的。
发表时间：2021年7月
发表期刊：Nature Communications
摘要
人们对于循环肿瘤细胞（CTC）在血液传播过程中转录组可塑性和适应性机制知之甚少。在此，我们使用单细胞全长RNA测序的方法检测了肝细胞癌患者（HCC）4个不同的血管部位的113个单CTC转录组，包括肝静脉（HV）、周围动脉（PA）、周围静脉（PV）和门静脉（PoV）。我们揭示了CTC的转录动力学与血液传播过程中的应激反应、细胞周期和免疫逃避信号有关。此外，我们发现趋化因子CCL5是CTC免疫逃避的一个重要介质。从机制上来描述，CCL5在CTC中的过表达受到p38-MAX信号的转录调控，它募集调节性T细胞（Tregs）以促进CTC的免疫逃逸和转移播种。总之，我们的研究结果揭示了以前被忽视的CTC空间异质性与免疫逃逸机制，这些结果可能有助于针对HCC患者设计新的抗转移治疗策略。
多项研究认为循环肿瘤细胞（CTC）是肝癌肝内和肝外转移（EHM）的“种子”。在播散过程中，CTC暴露在包含许多类型的压力的血液微环境中，例如失巢凋亡，剪切力，氧气/营养剥夺和免疫监视，只有克服这些困难癌细胞才能成功定植。因此，靶向CTC并研究其血液传播过程中的变化可能会揭示新的肿瘤转移机制。虽然CTC单细胞RNA测序（scRNA-seq）取得了较大的进展，但关于CTC传播过程中可塑性和适应机制的数据却很缺乏。包括本文作者团队在内的研究人员已经证明，CTC在血液运输过程中会动态激活上皮-间质转化（EMT），因此团队进一步假设，CTC在传播的过程中可能会在时间和空间上调节其表型和分子信号，以便在不适宜的微环境中存活并在远端定植。
为了研究这个问题，团队在六名HCC患者中分离CTC并通过EpCAM+/Pan-CK+和CD45-来鉴定（图2-1a，b），随后进行scRNA-seq或单细胞低通全基因组测序（LP-WGS）。所有经过测序的7个细胞都显示出拷贝数变异（CNV），而两个CD45+细胞（WBC）则没有（图2-1c），这表明使用该方法分离出的细胞可被认定为CTC。紧接着，团队找到10例根治性切除手术前的HCC患者，在肝静脉（HV）、周围动脉（PA）、周围静脉（PV）和门静脉（PoV）四个不同的血管部位分离出295个CTC，并选用其中119个来做进一步的测序分析，最终保留113个CTC。通过scRNA-seq和t-分布邻域嵌入算法（t-SNE）来得到二维的可视化数据图（图2-1d），结果显示CTC、原发肿瘤和细胞系被区分成三种不同的转录模式。通过基因集富集分析（GSEA）确定了CTC中上调的分子通路，包括细胞迁移和侵袭，细胞周期，抗凋亡，免疫反应和促进凝血的信号通路（图2-1e）。
接着，团队探索了CTC集群在迁移过程中的空间转录异质性。团队首先发现，从患者不同血管分离出来的CTC强烈地类聚于患者个体而非血管类型，这表明患者间的异质性要高于血管间的异质性（图2-2a）。接下来，团队分析了一位患者（P9）中四个血管位点CTC在细胞间转录的多样性，在HV中发现了具有显著异质性的CTC集群，而PA中的CTC则表现出显著降低的异质性（P < 0.001），PV和PoV则再次显示出中CTC异质性的增加（P < 0.001），在P9患者中观察到的CTC空间异质性模式在另外5位患者身上进一步得到了证实（图2-2b）。图2-2c描述了CTC通过PA从HV到PV来传播肝细胞癌的血流路径。接下来，团队对每个血管位点特异性表达的基因进行富集，发现HV的CTC表达了氧化磷酸化/外源性代谢相关基因，PA的CTC表达了与GPRC信号传导相关的基因，PV的CTC表达了免疫应答/细胞因子产生相关基因，而PoV的CTC则表达了细胞周期相关基因（图2-2d）。这些结果表明，来自不同血管的CTC在其转录谱中显示出明显的血管内/间异质性，暗示着在血液运输过程中，诸如血液动力学压力，细胞因子和免疫细胞的相互作用以及氧气/营养物质的剥夺等生物和物理诱因，会不断地调节CTC表型的多样性。
图2-1 基于RNA-seq表征CTC、原发灶和HCC细胞系之间的基因表达差异
团队进一步研究了CTC可塑性的分子机制，在差异表达分析中，团队发现了2428个在临近血管之间表达水平有显著变化的基因，总体而言，PA的CTC的转录活性降低，而PV和PoV的CTC转录活性则增加（图2-3a）。最显著的变化发生在HV的CTC和PA的CTC之间，下调的基因明显富集于有关细胞生长和增殖的通路，静脉血管参与MYC靶点和G2/M检查点通路的基因在一些CTC中再次上调（图2-3b），静脉血管中的CTC会过度表达缺氧相关基因，并将自身重编程为缺氧表型以应对缺乏氧气的环境（图2-3c）。细胞周期阶段的特异性特征在CTC的一个亚群中高度表达，并将循环细胞与非循环细胞区分开来（图2-3d）。从HV到PA，CTC中上调的基因强烈地富集于补体蛋白，EMT，血小板激活和趋化因子信号传导。值得注意的是，与EMT相关的基因（SPARC，IGFBP2），肿瘤细胞-血小板微聚集物形成相关基因（GP1BA，VWF）和免疫抑制趋化因子相关基因（CCL5，CXCL5）从HV到PA的表达增加，并且在PV和PoV中保留了他们的高表达水平（图2-3e）。
图2-2 CTC的空间转录异质性
接下来，团队对促进CTC产生免疫逃避的关键基因进行了差异表达分析，其中免疫抑制趋化因子CCL5在7个高表达基因中排在首位（图2-4a）。团队进一步通过IHC染色来检查CCL5在肿瘤微血管的CTC中上调表达的结果，与原发性肿瘤相比，CCL5在CTC中几乎完全表达（中位数：63% vs 2%, P = 0.021）（图2-4b）。团队进一步在一个独立的HCC队列（n=27）中进行验证，发现13名（48%）检测到 CCL5+ CTC，在41个CTC中有27个（66%）是CCL5+ CTC。CCL5从HV到PV中显著上调，并在PV和PoV中保持较高水平（图2-3e）。有关文献显示，CCL5参与募集免疫抑制性Tregs到肿瘤微环境，以促进免疫逃逸，团队证实了CCL5+ CTC在空间上与FOXP3+ Tregs非常接近，且与CCR5+ Tregs有正相关性，但与肿瘤周围血管中的CD3+ CD45RO+/-FOXP3- T细胞无关，这证实了两种细胞之间的相互作用（图2-4c）。CCL5+ CTC的数量与一个独立的HCC队列中CCR5+ Tregs的数量和总循环Tregs数量呈正相关（r = 0.87和0.86，P < 0.0001，n=27）（图2-4d）。Kaplan-Meier生存分析进一步揭示了CCL5+ CTC和循环Tregs平衡的临床意义，相比Treglow /CCL5+ CTClow，Treglow /CCL5+ CTChigh和Treghigh /CCL5+ CTClow，Treghigh /CCL5+ CTChigh具有统计学上显著缩短的疾病复发时间（TTR）和较差的总生存期（OS）（图2-4e）。综上所述，这些数据为团队的假设提供了强有力的临床证据，即CTC可能通过CCL5的表达来募集Tregs以促进免疫逃逸。
图2-3 单CTC转录组的动态变化突显了循环过程中应激反应和细胞周期异质性的通路改变
图2-4 CCL5+ CTC与Tregs呈正相关关系，可预测HCC患者的术后复发情况
团队还在4个具有不同转移潜力的HCC细胞系中表达CCL5，来验证CCL5能否促进新分离的循环Tregs的体外迁移能力，相比HepG2、Huh7和MHCCL这些低转移潜能的细胞系，具有高转移潜能的MHCC97H细胞系显示出较高的CCL5表达（图2-5a）。相比Huh7细胞系，MHCC97H能够显著提高募集Tregs的能力，而抗人类CCL5中和抗体则能够显著抑制Treg的迁移活性（图2-5b）。为了在体内验证CCL5募集Treg在CTC存活和转移形成方面的作用，团队在敲除/未敲除CCL5的免疫活性C57BL/6J小鼠中，通过尾静脉注射了5×106个Hepa1-6小鼠肝癌细胞（图2-5c，d）。相比空载体对照组，CCL5敲除小鼠能够在12个小时内更快地清除Hepa1-6细胞，注射到Treg耗尽的小鼠体内的空载体对照细胞的清除速度也明显快于对照组（图2-5e）。团队进一步评估了通过尾静脉注射表达CCL5的HCC细胞对循环Tregs数量的影响，结果显示注射后6h，CCL5敲低组比对照组的循环Tregs数量显著减少（图2-5f）。CCL5耗尽的Hepa1-6细胞表现出显著受损的肺部和肝转移能力（图2-5g），并且CCL5下调消除了Treg募集并促进活化的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的浸润（图2-5h）。添加CCL5抗体可以有效地阻断对照组CTC在体外募集Tregs的能力（图2-5i）。这些体外和体内测定结果表明，CTC利用自防御机制，通过CCL5来募集Tregs并在血液运输过程中建立有利于转移的微环境。
为了确定CCL5候选调节因子，团队首先在单细胞数据集中筛选了表达与CCL5正相关的转录因子（TF），与原发肿瘤相比，CTC中上调的43个TF有33个与CCL5表达呈正相关，MYC相关因子X（MAX）具有最高的排名（r = 0.86, P = 2.04×10−35）（图2-6a）。进一步的KEGG分析表明CTC中上调的基因在p38 MAPK通路富集，表明p38-MAX信号活化在调控CTC的CCL5转录方面发挥作用。通过染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因分析，结果显示在MHCC97H细胞系中MAX能够直接结合CCL5基因的启动子（图2-6b）。通过siRNA敲低的MAX和通过抑制剂阻断p38 MAPK通路，均可显著抑制CCL5表达（图2-6c，d），与对照组相比，MAX和CCL5耗尽能够抑制Hepa1-6细胞增殖和迁移的潜力（图2-6e），通过IHC染色，我们进一步发现MAX和CCL5敲除都与Tregs显著减少和活化的CTLs浸润相关（图2-6f）。为了进一步研究Tregs如何帮助诱导CCL5在HCC细胞中的表达，团队在有/无Tregs共培养的Huh7细胞的培养基中使用流式微球技术（CBA）检查了五种成熟的Tregs衍生细胞因子，包括TGF-β1，IL-10，IL-35，VEGF和TNF-α，结果显示TGF-β1是其中含量最高的细胞因子（图2-6g）。此外，MAX的耗尽或抑制p38信号传导显著阻断了TGF-β1诱导的CCL5在MHCC97H细胞中的表达（图2-6h）。这些证据综合表明外周Tregs通过p38-MAX信号传导分泌TGF-β1来诱导CCL5表达。
图2-5 CTC通过CCL5的表达来募集Tregs，以产生一个免疫抑制和促进肿瘤发生的微环境
图2-6 p38-MAX途径介导CCL5的诱导表达
CTC的异质性在不同的血管室之间存在显著差异，从肿瘤部位转移至血管中的CTC可能代表肿瘤内的异质性。研究者基于单细胞转录组测序来研究HCC患者4个血管部位CTC转录组的动态变化，揭示了CTC在血液转运中的可塑性，利用多种免疫逃避策略，包括EMT、血小板-CTC聚集体和免疫抑制趋化因子的产生。团队进一步发现了通过p38-MAX调控CCL5表达并募集Tregs，内在和外在信号协同作用，促进CTC的免疫逃逸和转移。该团队的发现提出了靶向Tregs的免疫治疗可作为一种有前景的抗肿瘤策略，靶向CCL5或者CCR5/4可以提供消灭血管内CTC的机会，阻止它们到达远端器官，降低HCC发生转移的风险。
这项研究的局限性是每个血管部位进行测序的CTC数量相对较少，并且分离出的CTC中，超过一半没有通过scRNA-seq的质量控制。CTC的单细胞RNA测序实验包含了复杂、多步骤的流程：CTC富集、表征、单细胞操作、测序准备，以及许多其他可能损害单个CTC RNA质量的因素。因而，获取大量适合进行下游生物信息学分析的单CTC转录组数据极其困难，未来需要优化CTC单细胞RNA测序相关的实验流程。
Detection of Circulating Tumor Cells and Their Implications as a Biomarker for Diagnosis, Prognostication, and Therapeutic Monitoring in Hepatocellular Carcinoma
循环肿瘤细胞检测及其作为肝细胞癌诊断、预后和治疗监测生物标志物的意义
发表时间：2021年1月
发表期刊：Hepatology
西达赛奈医学中心的Ju Dong Yang团队总结了循环肿瘤细胞（CTC）作为生物标志物，在肝细胞癌（HCC）的诊断、预测和疗效监测方面的作用。团队回顾了目前基于CTC的免疫亲和力、生物物理学性质和无富集方法的检测平台，并归纳了CTC在肝细胞临床治疗中的相关研究。
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一。HCC的不良预后主要归因于晚期肿瘤，这个阶段尚无有效的治疗方法能让患者长期生存。目前可用的检测方法，如甲胎蛋白（AFP）作为HCC诊断或预后生物标志物的准确性有限。肝活检提供的组织可以揭示肿瘤的生物学特征，但具有侵袭性和肿瘤播种的风险，不宜用于常规的检测，尤其是在早期患者中。除此之外，由于肿瘤内异质性，肝活检在全面揭示肿瘤生物学特征方面也受到限制。对新的生物标志物的需求是显而易见的，尤其是在改善HCC检测、预后、预测治疗反应和疾病监测方面，而液体活检则可能是早期发现和治疗HCC的有效方法。循环肿瘤细胞（CTC）是来源于原始肿瘤或转移灶的循环中的癌细胞，通过液体活检对其进行检测，能够促进精准医疗在HCC患者中的实施，具有巨大的潜力。CTC可以通过简单的外周血抽血检测，并显示肿瘤的整体特征。基于免疫亲和力和生物物理特性开发了各种CTC检测平台，以高效鉴定和捕获CTC。CTC的定量丰度，以及CTC的生物学特征和基因组异质性，可以预测HCC患者的疾病预后和治疗反应。这篇综述文章将讨论目前可用的CTC检测和分离技术、它们在HCC患者临床管理中的实用性、它们的局限性和未来的研究方向。
肝细胞癌（HCC）在全球癌症并发中位居第六，在癌症死亡中位居第四。HCC生物标志物在早期检测和预后以及预测和监测治疗反应方面存在未满足的需求。目前，甲胎蛋白 （AFP）是HCC应用最广泛的生物标志物。每年两次的肝脏超声检查联合/不联合血清AFP是美国肝病研究学会（AASLD）、亚太临床实践指南（APASL）、欧洲肝脏研究协会（EASL）推荐的HCC主要筛查策略。然而，AFP敏感性差，作为HCC早期检测的生物标志物的作用受到限制，基于蛋白的血清肿瘤标志物如AFP凝集素组分（AFP-L3）和脱羧基凝血酶原（DCP）与AFP联合使用时可改善诊断。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、细胞角蛋白19（CK19）、高尔基体蛋白73（GP73）、中期因子（Midkine）、骨桥蛋白（Osteopontin）、鳞状细胞癌抗原（SCCA）、和膜联蛋白A2（Annexin A2）均已被证明在HCC患者中具有诊断和预后作用，但尚未被广泛应用于临床实践。肝活检可对肿瘤组织进行直接采样，并进行肿瘤的分子表征。然而，它是一种侵入性检测，有出血和肿瘤播种的风险。此外，HCC具有显著的肿瘤间和肿瘤内异质性，含有少量肿瘤组织的单个活检标本可能无法代表整个HCC肿瘤组织。近年来，多种对HCC生物标志物进行检测的“液体活检”技术显示出可期的前景，其中循环肿瘤细胞（CTC）具有独特性，因其代表了对患者活肿瘤细胞的取样。对CTC进行分析，例如识别靶基因的特定突变，有助于预测治疗反应和耐药性，并指导治疗计划。这篇综述文章将讨论CTC相关的生物学，当前和新兴技术，以及在HCC诊断和预后方面的各种研究。
一、对CTC生物学和临床意义的概述
恶性肿瘤在增殖并侵入临近组织的过程中，通过分泌基质金属蛋白酶来断裂基底膜，并使得肿瘤进入附近血液和淋巴管（图3-1）。一旦进入血流，肿瘤细胞就会变成CTC，并在循环的过程中到达身体的不同组织并侵入它们。虽然大多数CTC被失巢凋亡、免疫攻击或剪切应力杀死，但CTC在上皮-间质转化（EMT）的过程中却获得了生存能力，并进一步提高了其转移能力。CTC还会与纤维原细胞、白细胞、内皮细胞或血小板形成CTC簇，相比单个CTC，CTC簇具有更高的存活能力和转移潜能。有研究表明，原发灶和转移灶的肿瘤细胞具有显著的异质性，因此，CTC液体活检不应当被视为组织活检的一种侵入性较小的替代方法，而是对肿瘤的异质性进行全面了解的方法。
CTC液体活检具有很高的前景，但在广泛应用之前，仍有技术障碍需要攻克。CTC在血液循环中的数量极少，且往往与肿瘤体积成正比，这使得早期疾病的CTC检测具有很高的挑战性。因此，将CTC检测的灵敏度和特异性提高到准确和全面的分子表征所必需的水平，是接下来CTC检测技术发展的挑战之一。ctDNA是液体活检的另一个主要方面，主要来源于濒死的肿瘤细胞或者吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞，ctDNA可用于鉴定异质性肿瘤的特异性突变和表观遗传学改变，并监测接受治疗中患者的肿瘤状态。但是，目前还不清楚ctDNA能否准确代表增殖活跃和发生转移的肿瘤细胞的基因组成。与ctDNA相比，CTC液体活检的主要优势是能够捕获完整的、有活力的肿瘤细胞。只要保留细胞的完整性，捕获的CTC可用于功能分析试验，并进行培养以评价耐药性。
图3-1 HCC CTC的生成、富集和生物学特征
二、CTC的检测和分离
目前已经开发了几种系统来改善CTC的检测和分离。检测平台主要可分为三类：基于免疫亲和力、基于生物物理性质和无富集方法（表3-1，3-2，3-3）。
免疫亲和力
基于免疫亲和力的CTC富集技术使用针对细胞表面标志物的抗体，它们通常被修饰在检测设备表面或者磁性物质上。阳性富集通常指使用针对CTC表面表达的特异性肿瘤相关抗原的抗体进行捕获，阴性富集则指使用抗CD45的抗体来减少造血细胞。直到近年来，CTC被定义为有核上皮细胞粘附分子EpCAM+/CK+/CD45-细胞。CellSearch系统是唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CTC诊断技术，使用EpCAM抗体包被的磁珠实现分离。CTC-chip等微流控设备由抗体包被的微柱组成，以几何方式排列以优化细胞附着效果。CTC-iChip结合了微流控和免疫磁性技术，其高于CellSearch平台的灵敏度已得到证明。Wang等人开创了“NanoVelcro”的独特概念，使用抗体包被的纳米基底与微流控集成混合器来促进CTC与基底的接触，以增强对CTC的捕获能力。
表3-1 基于免疫亲和力的CTC检测平台
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基于免疫亲和力的CTC检测平台 |
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检测平台 |
平台原理 |
关键特征 |
捕获率 |
参考文献 |
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CellSearch |
免疫磁性法 |
抗EpCAM的功能化磁珠。FDA唯一批准的用于转移性前列腺、乳腺癌和结直肠癌的CTC计数平台 |
≥85% |
1 |
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MACS |
免疫磁性法 |
磁性纳米粒子（MNPs）与各种抗体偶联；相对表面积大；可用于阳性/阴性富集 |
40%-90% |
2 |
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SERS |
免疫磁性法 |
磁性纳米粒子（MNPs）作为CTC富集平台和表面增强拉曼散射（SERS）信号扩增基底；使用抗ASGPR纳米颗粒和抗GPC3纳米棒进行对HCC CTC进行双重选择性分离 |
>90% |
3 |
|
SE-iFISH |
免疫磁性法；原位核型分析 |
结合差相富集，随后进行原位表型和核型表征；特别适用于鉴定非整倍体染色体 |
70%-87% |
4 |
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CTC-chip |
微流控 |
呈几何排列的微柱 (µpCTC-Chip) 产生层流以优化细胞附着；鲱骨状槽 (HBCTC-chip) 和微涡增加细胞接触到的抗体涂层的表面；高纯度全血处理 |
>60% |
5 |
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CTC-iChip† |
微流控；免疫磁性法；惯性聚焦 |
按顺序排列：微柱阵列、惯性聚焦和磁泳（使用确定性侧向位移分离包括CTC和WBC在内的有核细胞，在微流控通道中排列有核细胞，并收集磁性标记的细胞）；结合微流体和磁性的细胞分选 |
97% |
6 |
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NanoVelcro† |
微流控 |
抗EpCAM/抗ASGPR/抗GPC-3包被的纳米基底，微流控集成混合器促进CTC与基底接触，增强HCC-CTC的捕获。波形蛋白(+) CTC被确定为HCC的不良预后亚组 |
80%-94% |
7 |
生物物理学性质
使用“无标记”方法（膜过滤、密度梯度分层、惯性聚焦等技术）来区分CTC和血细胞，能够对CTC的下游处理更加容易，因为分离出的CTC没有抗体标记。微孔过滤的主要优势在于快速处理血液并进行CTC富集，但是微孔过滤可能受到堵塞的影响，白细胞和CTC尺寸上的交叠增加了高纯度富集的挑战性。密度梯度离心主要基于白细胞和CTC之间比重的差异，Ficoll-Paque已经能够在各种癌症患者中检测CTC，OncoQuick结合离心和过滤技术，比Ficoll-Paque的CTC捕获率更高，RosetteSep整合免疫亲和力与密度离心技术，并使用靶向广泛抗原混合物的抗体复合物。离心的方式由于可靠和廉价被广泛应用于CTC分离，但最好作为其他富集策略之前的初始步骤使用。惯性聚焦利用不同大小细胞惯性效应之间的差别来筛分CTC，适用于筛分尺寸大于血液细胞的CTC，该方法已被整合到许多微流控装置中，这些设备检测CTC的灵敏度高，并且CTC能够保持一定活性。双向电泳技术（DEP）利用CTC和血细胞介电性质的差异来分离CTC，DEPArray可以在DEP笼中捕获单个CTC并用于高特异性的遗传分析。
表3-2 基于生物物理特性的CTC检测平台
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基于生物物理特性的CTC检测平台 |
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检测平台 |
平台原理 |
关键特征 |
捕获率 |
参考文献 |
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ISET |
微孔过滤 |
基于细胞尺寸分离通常大于血液细胞的CTC；聚碳酸酯轨道蚀刻薄膜中有纳米至微米级别的孔隙 |
N/A |
8 |
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ScreenCell |
微孔过滤 |
基于细胞尺寸分离通常大于血液细胞的CTC；聚碳酸酯轨道蚀刻薄膜中有纳米至微米级别的孔隙 |
74%-91% |
9 |
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CellSieve |
微孔过滤 |
精确排列的孔隙，能够在低压状态下捕获CTC，并保存胞内结构 |
83%-91% |
10 |
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FMSA |
微孔过滤 |
柔性聚合物微弹簧可最大限度地减少细胞损伤；可直接从全血中快速富集 |
90% |
11 |
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CanPatrol |
微孔过滤；免疫磁性法 |
微滤后使用RNA原位杂交检测EMT标志物 |
80%-89% |
12 |
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Ficoll-Paque |
密度梯度离心法 |
价格低廉，易与其他技术结合使用；CTC与PBMC的比值保持不变 |
84% |
13 |
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OncoQuick |
密度梯度离心法；微孔过滤 |
分离介质上方存在多孔滤膜，通过过滤进行额外分离；CTC捕获率优于Ficoll-Paque |
87% |
14 |
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RosetteSep CTC Enrichment Cocktail |
密度梯度离心法；免疫磁性法 |
靶向广泛CTC抗原混合物的抗体复合物；可配合Ficoll-Paque等离心平台以提高捕获效率 |
36%-60% |
15 |
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DEPArray |
双向电泳 |
通过电极阵列在DEP笼中捕获单细胞；可以回收单个 CTC |
N/A |
16 |
无富集方法
所有富集技术都需要对捕获的细胞进行验证，而高速、荧光成像的发展促进了在没有富集步骤的情况下直接识别血液样本中的CTC，这节约了大量的时间。成像流式细胞术利用较高的核质比、大小等参数区分CTC和白细胞。光声流式细胞术（PAFS）基于激光技术实时检测静脉中的CTC，并直接成像。检测CTC的功能试验，利用肝细胞活性的各个方面，如肿瘤相关蛋白的分泌和CTC优先粘附到特殊的基质上。
表3-3 基于无富集技术的CTC检测平台
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基于无富集技术的CTC检测平台 |
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检测平台 |
平台原理 |
关键特征 |
捕获率 |
参考文献 |
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ImageStream |
成像流式细胞术 |
利用大小、核质比的差别检测CTC；无需抗体或复杂的血样处理 |
N/A |
17 |
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PAFC |
体内直接成像 |
吸收激光的纳米颗粒通过抗体标记在靶向细胞上；使用基于激光的技术实现静脉中CTC实时检测 |
N/A |
18 |
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EPISPOT |
功能测定 |
通过鉴定单个上皮型癌细胞分泌/释放/脱落（基于抗体）的蛋白，在单细胞水平上检测CTC。理论上可与任何CTC富集步骤相结合。 |
N/A |
19 |
三、CTC作为生物标志物在HCC患者中的研究
基于EpCAM的CTC检测相关临床研究
常用的、基于免疫亲和力的CTC富集技术如CellSearch已被用于检测和捕获HCC患者的EpCAM+ CTC（表3-4）。2013年，Sun等使用CellSearch检测接受肿瘤切除的HCC患者的EpCAM+ CTC，术前有67%的HCC患者检测出EpCAM+ CTC，术前CTC计数≥2被证明是术后肿瘤复发的预测因素。使用CellSearch的其他研究表明，HCC患者中EpCAM+ CTC的存在与血管浸润、AFP显著升高、更晚期的巴塞罗那分期（BCLC）、疾病进展、更高的复发率和更短的总生存期相关。2014年，Guo等建立了基于阴性富集和逆转录PCR（RT-PCR）检测EpCAM+ CTC的优化平台，与CellSearch系统的一致性达到76.7%。2016年，Wang等人使用CTC-BioTChip在60%的HCC患者（n = 42）中检测EpCAM+ CTC，发现CTC的阳性率和数量与肿瘤、淋巴结和转移分期均有显著相关性。2016年，Zhou等人研究了EpCAM+ CTC和调节性T细胞（Treg）对HCC患者的预后价值，发现EpCAM+ CTC和Treg水平升高与早期复发和临床预后不良有关。不幸的是，基于EpCAM的CTC富集平台受到发生EMT的CTC中上皮标记物缺失的限制。此外，有研究表明，只有部分（30%-40%）HCC细胞表达EpCAM。
表3-4 基于EpCAM的CTC检测研究
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基于EpCAM的CTC检测研究 |
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研究 |
患者 |
平台和方法 |
标志物 |
主要发现 |
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Sun et al.,(20) 2013 |
肝细胞癌 (n=123);良性肝病 (n=5); 健康志愿者 (n=10) |
CellSearch |
EpCAM |
67%的术前患者发现CTC，28%在切除后1个月发现CTC；≥2个CTC/7.5 mL预示复发 |
|
Schulze et al.,(21) 2013 |
肝细胞癌 (n=59); 良性肝病 (n=19) |
CellSearch |
EpCAM |
31%的HCC患者中发现CTC；与晚期、血管浸润和较短的总生存期相关 |
|
Guo et al.,(22) 2014 |
肝细胞癌 (n=299); 肝良性肿瘤 (n=24);慢性肝病 (n=25); 健康志愿者 (n=71) |
RosetteSep, MACS, RT-qPCR |
EpCAM |
ROC曲线下面积（0.70）；敏感性（42.6%）；特异性（96.7%）。结合AFP水平，ROC曲线下面积改善至0.86，灵敏度（73.0%），特异性（93.4%） |
|
Kelley et al.,(23) 2015 |
肝细胞癌 (n=20); 良性肝病 (n=10) |
CellSearch |
EpCAM |
40%的转移性HCC患者发现CTC；≥1/7.5 mL与血管浸润和总生存期降低相关 |
|
Wang et al.,(24) 2016 |
肝细胞癌 (n=42) |
CTC-BioTChip |
EpCAM |
60%的HCC患者中发现CTC；CTC阳性率和数量与TNM分期高度相关 |
|
Zhou et al.,(25) 2016 |
根治性切除的肝细胞癌患者 (n=49); 健康志愿者 (n=50) |
RosetteSep, Quantitative RT-PCR |
EpCAM, CD4+CD25+Foxp3+ |
EpCAM mRNA+ CTC和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量高的患者术后复发 (67% vs.10%) 和1年复发 (50% vs.10%) 的风险更高 |
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von Felden et al.,(26) 2017 |
手术切除的肝细胞癌患者 (n=57) |
CellSearch |
EpCAM |
15%的HCC患者发现CTC；CTC阳性与高复发率和短中位无复发生存期相关 |
|
Shen et al.,(27) 2018 |
经动脉化疗栓塞的肝细胞癌患者 (n=89) |
CellSearch |
EpCAM |
56%的HCC患者发现CTC；CTC数量增加与死亡和进展相关 |
|
Yu et al.,(28) 2018 |
肝细胞癌 (n=139); 肝良性肿瘤 (n=23) |
CellSearch |
EpCAM |
CTC≥2的患者的无疾病生存期和总生存期短于CTC<2的患者 |
基于联合标志物的CTC检测相关临床研究
为了克服基于EpCAM的CTC检测平台在HCC中的低灵敏度，一些研究关注了替代性标志物（表3-5）。例如，去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种仅在肝细胞表面表达的跨膜蛋白，已被用于多种对HCC患者进行CTC检测的富集方法中。2011年，Xu等利用生物素化的无唾液酸胎球蛋白（ASGPR的配体）结合HCC细胞进行免疫磁性分离，能够在81%的HCC患者中检测到CTC。CTC的存在和CTC的数量均与肿瘤范围、合并门静脉癌栓和分化状态显著相关。2014年，合成的抗ASGPR抗体代替ASGPR配体，在89%的HCC患者中检出CTC。通过使用抗ASGPR和CPS1的抗体混合物，结合阴性富集，在HCC患者中实现了91%的CTC检出率。2016年，Zhang等人使用具有ASGPR、P-CK和CPS1抗体的CTC芯片，从100%的HCC患者（n=36）中分离出CTC。Court等人使用NanoVelcro CTC Assay与EpCAM、ASGPR和GPC3的多标记组在97%的HCC患者中检出CTC。
表3-5 基于联合标志物的CTC检测研究
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基于联合标志物的CTC检测研究 |
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研究 |
患者 |
平台和方法 |
标志物 |
主要发现 |
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Xu et al.,(29) 2011 |
肝细胞癌 (n=85); 良性肝病 (n=37); 其他恶性肿瘤 (n=14); 健康志愿者 (n=20) |
AutoMACS |
ASGPR, HER2, TP53 |
81%的HCC患者中发现CTC；CTC的阳性率和数量与肿瘤范围、合并门静脉癌栓、分化状态和疾病范围相关 |
|
Li et al.,(30) 2014
|
肝细胞癌 (n=27); 其他恶性肿瘤 (n=12); 肝硬化 (n=13); BLT (n=11); 慢性肝炎 (n=7); 健康志愿者 (n=15) |
AutoMACS
|
ASGPR, CPS1, P-CK
|
89%的HCC患者中发现CTC；特异性抗ASGPR和高效富集HCC-CTC；联合抗P-CK和抗CPS1（96.7%）优于单独使用一种抗体（CPS1：62.1%；P-CK：85.2%）
|
|
Mu et al.,(31) 2014 |
肝细胞癌 (n=62); 慢性肝炎 (n=7); 健康志愿者 (n=15) |
MidiMACS |
ASGPR, GPC3, CK |
HCC患者GPC3、ASGPR、CK表达增加；阳性/阴性预测值分别为：GPC3（90%和71%）、ASGPR（93%和75%）、CK（83%和29%）；GPC3和ASGPR表达与总生存期降低相关 |
|
Liu et al.,(32) 2015 |
肝细胞癌 (n=32); 其他恶性肿瘤 (n=17); BLT (n=12); 肝硬化 (n=15); 慢性肝炎 (n=10); 急性肝炎 (n=3); 健康志愿者 (n=20) |
Ficoll-Paque，RosetteSep |
ASGPR, CPS1 |
白细胞的CD45消耗相比ASGPR+选择能够回收更多的CTC；与任意抗体单独使用相比，抗ASGPR和抗CPS1联合使用改善了CTC检测，能够在91%的HCC患者中检测到CTC |
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Zhang et al.,(33) 2016 |
肝细胞癌 (n=36); 良性肝病 (n=14) |
CTC-chip |
ASGPR, P-CK, CPS1 |
在100%的HCC患者中检测到CTC；捕获的CTC很容易从CTC芯片中释放出来，随后可以在三维细胞培养试验中扩增成球样结构 |
|
Pang et al.,(3) 2018 |
肝细胞癌 (n=8); 健康志愿者 (n=5) |
表面增强拉曼光谱（SERS） |
ASGPR, GPC3 |
SERS纳米平台在100%的HCC患者中检测到CTC；能够用少量血液进行检测 |
基于无标记（生物物理和无富集）方法检测CTC的相关临床研究
表3-6列举了使用无标记方法检测HCC患者的CTC。2000年，Vona等人使用二维微孔过滤系统ISET检测接受肝切除的HCC患者的CTC，并且能够在术中捕获肿瘤微栓子。与CellSearch平台检测患者CTC的能力相比， ISET的性能显著优越于CellSearch系统（ISET：100%；CellSearch：28%）。然而，ISET却难以释放CTC进行下游遗传分析。2016年，Liu等人使用成像流式细胞术（IFC）从HCC患者的血液样本中检测CTC，使用在CTC里观察到的较高核质比（HKR），与传统的基于CD45-EpCAM+ CTC的检测方法相比，使用HKR细胞的IFC显示出显著更大的受试者工作特征曲线下面积（AUC，0.82 vs. 0.73）。Ogle等人研究了以细胞大小为重点的IFC，并将其有效性与由CK、EpCAM、AFP、GPC-3和DNA-K组成的多标记组进行了比较。IFC纳入大小标准，结合CD45细胞的耗竭，导致捕获所有阳性生物标志物CTC，以及另外28%不表达任何检测的生物标志物的CTC。IFC的优点是易于操作，成本效益高，不需要抗体或复杂的血样处理。然而，其特异性可能受到免疫细胞存在的限制，免疫细胞也具有较大的体积和HKR。
表3-6 基于无标记技术的CTC检测研究
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基于无标记技术的CTC检测研究 |
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研究 |
患者 |
平台和方法 |
标志物 |
主要发现 |
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Vona et al.,(8) 2000 |
手术切除的肝细胞癌患者 (n=7); 慢性肝炎 (n=8); 健康志愿者 (n=8) |
ISET；RT-PCR |
AFP, PSA |
HCC患者术前/术后CTC检出率分别为43%和86%。ISET允许在手术过程中对细胞形态、CTC计数进行后续分析，并证实肿瘤微栓子的存在 |
|
Vona et al.,(34) 2004 |
肝细胞癌 (n=44); 慢性肝炎 (n=30); 肝硬化 (n=39); 健康志愿者 (n=38) |
ISET |
N/A |
52%的HCC患者中发现CTC；与门静脉瘤血栓形成和生存期缩短相关 |
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Morris et al.,(35) 2014 |
肝细胞癌 (n=52) |
ISET；CellSearch |
EpCAM, GPC-3 |
ISET在100%的HCC患者中检测到CTC（CellSearch为28%）；ISET检测GPC-3阳性CTC与原始肿瘤中的GPC-3阳性细胞一致率为100% |
|
Liu et al.,(17) 2016 |
肝细胞癌 (n=52); 健康志愿者 (n=12) |
IFC |
HKR |
使用HKR，IFC的AUROC为0.82。HCC患者微血管血栓形成的发生率显著较高，复发风险和死亡率也较高 |
|
Ogle et al.,(36) 2016 |
肝细胞癌 (n=69); 肝硬化 (n=16); 健康志愿者 (n=15) |
IFC |
Cell size, CK, EpCAM, AFP, GPC-3, DNA-K |
CTC增加与肿瘤分期较晚、门静脉血栓形成和生存期较差相关 |
CTC的生物学特性和异质性
多标志物组合面板和下游分子分析可以揭示HCC患者CTC的生物学特征和异质性（表3-7），而鉴定表达特定肿瘤标志物和药物靶标的CTC允许提供者预测对治疗的反应。这些检测包括：pERK+/pAkt- CTC、PD-L1+ CTC、BLCL分期、EMT标志物（波形蛋白和Twist）、AFP水平、染色体异倍体等。
表3-7 基于CTC生物学特性和异质性的检测研究
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CTC的生物学特性和异质性 |
||||
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研究 |
患者 |
平台和方法 |
标志物 |
主要发现 |
|
Li et al.,(37) 2013 |
肝细胞癌 (n=60); 良性肝病 (n=10); 其他恶性肿瘤 (n=10); 健康志愿者 (n=10) |
MiniMACS；Flow cytometry |
ASGPR, vimentin, twist, ZEB1/2, snail, slug, cadherin |
77%的HCC患者检测到CTC；门静脉血栓和晚期患者CTC阳性率较高；EMT标志物与门静脉血栓、TNM分类、肿瘤大小高度相关 |
|
Li et al., (38) 2016 |
索拉非尼治疗的肝细胞癌患者 (n=109) |
Ficoll-Paque；RosetteSep |
pERK, pAkt |
pERK/pAkt在CTC和组织中的表达一致，均为90%；pERK+/pAkt- CTC与无进展生存期相关，对预后效果的预测良好；在体外实验中，pERK+/pAkt-HCC细胞对索拉非尼反应最大 |
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Shi et al., (39) 2016 |
冷冻消融的肝细胞癌患者 (n=47) |
MACS；RT-qPCR |
MAGE-3, surviving, CEA |
冷冻手术后CTC的平均水平显著降低；肿瘤标志物MAGE-3、存活和CEA相关基因表达在冷冻手术后均显著降低 |
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Kalinich et al., (40) 2017 |
肝细胞癌 (n=63); 慢性肝病 (n=31)；肝转移 (n=6); 其他恶性肿瘤 (n=38); 健康志愿者 (n=26) |
CTC-iChip；Digital-PCR |
AFP, AHSG, ALB, APOH, FABP1, FGB, FGG, GPC3, RBP4, TF |
10个肝脏特异性转录本在56%未治疗的肝细胞癌患者和3%有发生肝细胞癌风险的非恶性肝病患者中鉴定出CTC；接受治疗的HCC患者CTC阳性率下降 |
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Chen et al., (41) 2017 |
肝细胞癌 (n=195) |
CanPatrol |
CK, EpCAM, twist, cadherin, snail, |
95%的HCC患者中检测到CTC；能够区分转移性HCC：AUROC（0.86）、敏感性（86%）、特异性（81%）；间质CTC与年龄、BCLC分期、转移、AFP水平和复发相关 |
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Court et al., (42) 2018 |
肝细胞癌 (n=61); 良性肝病 (n=11); 健康志愿者 (n=8) |
NanoVelcro CTC Assay |
EpCAM, ASGPR, GPC3, vimentin |
97%的HCC患者中检测到CTC；灵敏度（84.2%）、特异性（88.5%）、阳性预测值（69.6%）、阴性预测值（94.7%）AUROC（0.92）；波形蛋白阳性CTC与侵袭性疾病和转移相关 |
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Qi et al., (43) 2018 |
R0切除肝细胞癌患者 (n=112); 健康志愿者 (n=20) |
CanPatrol |
EpCAM, CK, vimentin, |
90%的HCC患者中检测到CTC；与复发和转移相关的CTC计数≥16、间质-CTC百分比≥2%；BCAT1基因被确定为EMT的触发因素 |
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Ou et al., (44) 2018 |
根治性切除的肝细胞癌患者 (n=165) |
CanPatrol |
EpCAM, CK, Vimentin, twist |
71%的HCC患者中检测到CTC；CTC增加与AFP升高、多发性肿瘤、癌症晚期和肿瘤栓塞相关；间质CTC可预测早期复发和最短的无进展生存期 |
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Yin et al., (45) 2018 |
肝细胞癌 (n=80); 健康志愿者 (n=10) |
CanPatrol |
Twist |
Twist+与肿瘤负荷/侵袭性、分期以及术后复发和死亡率相关 |
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Ye et al., (46) 2018 |
肝细胞癌 (n=42) |
CanPatrol |
TP53 |
术后CTC计数和CTC数量变化是无进展生存期的独立预后指标 |
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Cheng et al., (47) 2018 |
肝细胞癌 (n=113); 两性肝癌 (n=57); 肝转移 (n=6) |
CanPatrol |
CK, EpCAM, Vimentin, twist |
CTC总数的AUROC（0.774），联合血清AFP后提高至0.821；晚期HCC患者间质CTC增加 |
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Wang et al., (12) 2018
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根治性切除肝细胞癌患者 (n=62)
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CanPatrol |
CK, EpCAM, vimentin，twist |
84%的HCC患者中检测到CTC；术后复发患者的CTC、间质型CTC和混合型CTC数量明显更多；间质CTC与术后无病生存期缩短相关 |
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D’Avola et al., (48) 2018 |
肝细胞癌 (n=6)；健康志愿者 (n=1) |
scRNA-seq |
CK, EpCAM, GPC3, ASGPR1 |
CTC单细胞RNA测序显示出明显的转录组异质性；在相当大比例的非CTC细胞（主要是单核细胞）中检测到ASGPR1的非肝脏表达 |
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Sun et al., (49) 2018 |
根治性手术切除肝细胞癌患者 (n=73) |
CellSearch；RT-qPCR |
EpCAM, CK, cadherin, slug, vimentin, snail |
CTC的EMT状态在不同的血管腔室（外周静脉、外周动脉、肝静脉、门静脉、下腔静脉）中是异质性的 |
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Wang et al., (50) 2018 |
肝细胞癌 (n=14); 胆管上皮癌 (n=16); 胆囊癌切除患者(n=4) |
SE-iFISH |
C8 aneuploidy |
在检出的CTC中，EpCAM+占8%，EpCAM-占86%；发现小的非整倍体HCC CTC；术后三/多倍体CTC或循环肿瘤微栓子（CTM）的数量与不良预后相关 |
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Winograd et al., (51) 2018 |
肝细胞癌 (n=73); 良性肝癌 (n=11); 健康志愿者 (n=8) |
CTC-iChip |
PD-L1 |
PD-L1+ CTC的存在可预测抗PD1治疗的反应 |
总结：
CTC作为液体活检的一种形式，在促进HCC患者实施精准医疗方面具有巨大的潜力，在被广泛应用于HCC临床之前，仍然存在巨大的挑战。除了CTC的检测分离技术存在挑战之外，CTC的检测方法众多，各自样本制备和富集分析方案不统一，而临床研究的患者人口统计学差异大，这使得验证研究非常困难。因此，需要有一个高灵敏度和特异性的标准化检测方案，以捕获CTC全谱，这可以通过使用统一的CTC检测平台来进行更大样本的多中心、前瞻性研究来实现。
参考文献：
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晶准医学成立于2018年，落户大湾区，坐落于深圳坪山海科兴战略新兴产业园和香港科学园，是一家集精准医疗液体活检技术研发、产品转化、生产、销售以及检测服务为一体的国家高新技术企业。公司拥有国际先进、自主知识产权的微流控技术与核酸检测技术，为肿瘤液体活检提供全方位的精准诊断产品、方案以及服务。晶准医学在全国范围内率先推出“全方位肿瘤液体活检整体解决方案”，致力于提供高效和精准的个体化肿瘤液体活检检测产品和服务，实现肿瘤早诊早筛、精准诊断与实时监测。
公司技术力量雄厚，在国内外数位院士的带领和指导下，拥有数十位博士和硕士为主体的研发团队，开展多项与肿瘤液体活检技术相关的科学研究与产品开发。公司核心技术“微流控芯片上的细胞操控与检测技术平台”荣获2015年国家教育部自然科学二等奖、2016年药明康德生命化学奖、2019年亚洲国际创新大奖（金奖）以及第47届日内瓦国际发明展金奖，并在国际知名杂志上发表相关论文数十篇，拥有多项发明专利。公司曾作为粤港合作典范，受到了国家领导人习近平的关注并参观了研发实验室。由于公司发展迅速，更是被德勤评为2019《香港明日之星企业（Hong Kong Rising Star）》，且连续两届被评为粤港澳大湾区生物科技创新企业50强先锋企业。
公司拥有近3000平米的生产厂房，建有万级洁净车间、十万级洁净车间、PCR实验室及晶益医学检验实验室。严格按照国家药品质量管理体系（GMP）、医疗器械质量管理体系（YYT0287/IS013485）、欧盟生产质量标准（CE）建立了完善的肿瘤液体活检所需的研发、生产及检测服务体系。
晶准医学产品系列
一、晶准医学自主研发的首款CTC100循环肿瘤细胞分选仪已于2019年7月获国家药品监督管理局批准上市，具有高效便捷、灵敏特异、样本需求少、应用广泛的特点，全面领先目前市面上的同类产品。该设备已为临床提供CTC计数与分型信息，免疫治疗靶向蛋白检测以及用药靶点基因检测等信息，可拓展应用于全基因组测序、体外培养及药敏评估等，为肿瘤早期筛查、预后判断、伴随诊断、复发预警、疗效监测等提供精准信息。
CELLOMICS 循环肿瘤细胞检测平台
CELLOMICS 循环肿瘤细胞检测配套试剂盒
二、公司拥有“无需芯片”微滴式数字 PCR 平台，已于2021年9月获国家药品监督管理局批准上市，可实现微滴生成的自动化操作，满足客户的高通量、自动化实验需求，国际首创“无芯片式”微滴阵列打印技术，突破传统微滴制备影响因素复杂、芯片耗材成本居高不下、易导致珍贵样本分析失败和损失的风险等局限，大大降低了技术平台使用成本，为肿瘤基因检测提供更精准、成本更低的检测平台。该平台可同时适用于肿瘤组织标本和血液标本，适用于肺癌的EGFR低丰度突变检测，肺癌的ALK融合基因检测，乳腺癌的分型，单细胞的基因表达分析，甲基化分析，外周血MicroRNA的绝对定量，微小残留病变等临床应用。
全球首创“无需芯片”数字PCR平台
数字PCR配套试剂盒
三、基于高通量测序技术的早筛产品研发。公司与国际顶级医学院—美国希望之城医学院以及贝勒医学院进行核心专利授权转化。基于高通量技术以及独创的国际领先的生物信息学技术和算法，检测消化道肿瘤患者ctDNA甲基化情况。可用于包括食管癌、胃肠以及结直肠癌等的早期筛查，评估患癌风险，临床符合率达93%。同时，公司目前也正在联合多家医院开展基于液体活检miRNA组检测的结直肠癌和卵巢癌早筛产品大规模临床验证工作。
晶准医学项目特色
项目依托近20年研发积累的先进微流控技术和核酸检测技术，提供全方位肿瘤液体活检整体解决方案应用于肿瘤诊断全程管理，包括早诊早筛、辅助诊断、用药指导、实时监测等领域，利用微流控技术建立高效多功能的CTC检测与研究平台；利用核酸检测技术，高灵敏、高特异性地检测与肿瘤诊断相关的DNA与RNA信息，为肿瘤诊断提供精准的多样化临床信息。
晶准医学荣誉
▪2015年教育部自然科学二等奖
▪2016年获药明康德生命化学奖
▪2019年日内瓦国际发明展（金奖）
▪2019年亚洲国际创新大奖（金奖）
▪2019年21届中国国际高交会优秀产品奖
▪2019年深圳市创新创业大赛决赛
▪2019年工信部国际创新创业大赛香港季军
▪2019年第八届中国创新创业大赛行业总决赛
▪2019年德勤《香港明日之星企业 （Hong Kong Rising Star） 》
▪2020年第三届粤港澳大湾区生物科技创新企业50强——“先锋企业”
▪2021年第四届粤港澳大湾区生物科技创新企业50强——“先锋企业”和“最受欢迎企业”
▪2022年KPMG全球创新科技大赛中国赛区亚军
▪2022年ZAODX世界肿瘤早筛大会金筛奖·未来独角兽企业
