学术快讯 10|《PNAS》通过片段组学对游离DNA进行表观遗传学分析

研究的核心思路是利用CpG位点附近的cfDNA片段化模式来推断其甲基化状态，cfDNA的片段化模式由切割谱（Cleavage profile）描述，它根据CpG位点的甲基化状态而有所不同，为使用片段组学特征进行甲基化分析提供了基础。研究进一步关联两种类型的末端基序（CGN和NCG，其中N代表A、C、G或T），尝试构建一种简化的甲基化分析方法。此外，研究还探索了深度学习辅助推断甲基化状态的可行性，研究将这种基于片段组学的甲基化分析方法命名为FRAGMA。

FRAGMA检测cfDNA分子示意图

基于8名健康对照血浆DNA的亚硫酸氢盐测序结果，研究检查了高甲基化（甲基化胞嘧啶百分比＞70%）和低甲基化（甲基化胞嘧啶百分比＜30%）CpG位点相关的切割谱。结果显示，高甲基化CpG位点的裂解比例是低甲基化CpG位点裂解比例的两倍（位置0），在位置-1上，高甲基化CpG位点的裂解比例低于低甲基化CpG位点。并且这种关系在非亚硫酸氢盐测序数据中得到了重现。研究进一步探索了CGCG亚序列为代表的两个串联的CpG二核苷酸，相比低甲基化的CpG位点，高甲基化的CpG位点在位置0和2上的裂解比例更高。这些结果表明DNA甲基化与cfDNA裂解模式相关，且CpG位点较高的裂解比例与较高的甲基化水平相关。

基于CpG甲基化状态的裂解比例

cfDNA相对于CpG位点（0和-1）裂解比例的差异取决于甲基化状态，并且最终将导致末端基序的差异。甲基化的CpG位点趋于在0位点有更多的末端，富集5’ CGN基序，但在-1处较少，减少了5’ NCG基序，而未甲基化的CpG位点则减弱了这种情况。对于健康对照组的血浆DNA样本，高甲基化CpG位点的CGN/NCG基序比显著高于低甲基化位点。因此，来自基因组区域cfDNA分子的CGN/NCG基序比可以用来揭示该区域的甲基化水平。研究进一步分析了基于CGN/NCG基序比的甲基化分析可以达到的分辨率，结果表明，单核苷酸多态性（SNP）位点上携带G等位基因的DNA片段未甲基化，而携带A等位基因的DNA片段被甲基化，相比较携带G等位基因的DNA片段，携带A等位基因的cfDNA片段显示出更高的5’ CGN末端基序频率和更低的5’ NCG末端基序频率。这些结果表明，CGN/NCG基序还可以反应等位基因特异性甲基化模式。

CGN/NCG基序比分析

研究还以肝移植为模型，探索追踪CpG周围组织特异性切割谱的可行性。研究分析了先前报道的肝移植接收者血浆DNA样本，并确定了肝脏特异性的高/低甲基化CpG位点。与造血起源的共享DNA相比，供体来源的DNA导致肝脏特异性高甲基化CpG位点在0处的裂解比例增加了51%，而在-1处对应的比例下降了31.3%。肝脏特异性高甲基化CpG的CGN/NCG基序比与基于单核苷酸多态性（SNP）方法推导的供体来源DNA比例呈强正相关性，而肝脏特异性低甲基化CpG位点的切割谱则表现出与高甲基化CpG位点相反的模式，CGN/NCG基序比与供体来源的DNA比例呈负相关。

研究在肝细胞癌 (HCC) 患者中观察到来自Alu区域的CGN/NCG基序比与肿瘤DNA比例呈负相关，对比HCC患者和对照组的CGN/NCG基序比，发现HCC组低甲基化CpG位点的CGN/NCG基序比明显降低，且随着肿瘤的进展而下降。

研究进一步使用8名健康人和13名HBV携带者的亚硫酸盐测序结果来训练和测试卷积神经网络（CNN）模型，用来预测CpG是高甲基化还是低甲基化。结果显示CNN模型的AUC可达0.93。此外，与甲基化评分＞0.5的CpG位点相比，评分＜0.5的CpG位点甲基化指数显著降低。值得注意的是，如果仅使用CpG附近位点信息来训练CNN模型，而缺少cfDNA切割谱的数据集，则CNN模型的AUC大幅下降到0.72，证明cfDNA切割谱对甲基化分析的准确性有显著贡献。综上所述，这些结果证明利用cfDNA片段组学在单个CpG水平上推断甲基化状态的可行性。

CNN模型预测CpG位点的甲基化状态

这项研究证实了CpG位点周围cfDNA的片段化模式与其甲基化状态之间的关系，并发现使用切割谱可以推断基因组区域的甲基化模式，精度可达单个CpG位点。CGN/NCG基序比可作为癌症、器官移植和无创产前评估的潜在生物标志物。基于片段组学的甲基化分析方法（FRAGMA）可直接应用于血浆DNA大规模平行测序，将遗传学和表观遗传学分析集中在一个简化的检测流程中，为数据挖掘提供额外的维度。这项研究还证明基于切割谱的深度学习算法是一种识别CpG甲基化的可行方法，综上所述，这项研究为最大化血浆DNA测序价值提供了一种新的可能。