2021循环肿瘤细胞临床应用与实验室检测专家共识

循环肿瘤细胞临床应用与实验室检测专家共识

通信作者：郑磊，Email：nfyyzl@163.com；段勇，Email：duanyong7@139.com

 

【摘要】  循环肿瘤细胞检测具有非侵入性采样、可动态反映肿瘤基因谱全貌、提供肿瘤患者疾病状态相关的实时信息等优势，在肿瘤临床诊疗中的应用价值受到越来越多关注。在精准医疗的时代   背景下，为规范循环肿瘤细胞检测的合理应用，中华医学会检验医学分会分子诊断学组邀请多学科专家针对循环肿瘤细胞检测的临床应用、检测技术及质量管理中的关键问题进行讨论并推出相关共识。

【关键词】  肿瘤细胞，循环； 细胞诊断学； 质量管理

基金项目：国家杰出青年科学基金（82025024）；南方医科大学南方医院院长基金重点项目

（2019A002）；广东省省级科技计划项目（2016A010105006）

 

Chinese expert consensus on clinical application and laboratory test of circulating tumor cells

Molecular Diagnostic Group of Chinese Society of Laboratory Medicine

Corresponding author: Zheng Lei, Email: nfyyzl@163.com; Duan Yong, Email:duanyong7@139.com

【 Abstract 】 Circulating tumor cell test has the advantages of non‐invasive sampling, dynamic reflection of tumor gene spectrum and real‐time information related to tumor diseases. The clinical value of circulating tumor cell test in tumor diagnosis and treatment has attracted more and more attention now. In the era of precision medicine, in order to standardize the rational application of circulating tumor cells, Molecular Diagnostic Group of Chinese Society of Laboratory Medicine invited multidisciplinary experts to discuss and provide recommendations about the clinical application, detection technology and quality management of circulating tumor cell test.

【 Key words 】  Neoplastic cells, circulating; Cytodiagnosis; Quality management

Fund programs: National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2019A002); Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2016A010105006)

 

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是指从肿瘤病灶（原发灶或转移灶）脱落并进入外周血液循环的肿瘤细胞［1］，在肿瘤转移过程中发挥重要的作用。CTC 检测是推动肿瘤精准诊疗的液体活检新技术，与侵入式组织活检相比，CTC 检测具有样本易获取、可提供动态监测信息的优点；与另一液体活检标志物循环肿瘤核酸（circulating   tumorDNA，ctDNA）相比，CTC 为完整肿瘤细胞，携带有肿瘤细胞的多组学信息（基因组、转录组、蛋白组、代谢组等），且利用活细胞CTC 可实现体外肿瘤细胞形态和功能的分析［2］。CTC 计数、分子分型及下游分析在肿瘤疗效评价、预后评估与辅助治疗决策中有广阔的应用前景。

 

CTC 检测技术发展迅速，其在肿瘤临床诊疗中的应用价值也越来越受关注，但目前尚无统一的CTC 检测技术行业标准和应用指南，业界对该技术的临床适用场景、检测流程及质量管理等方面仍有 困惑。为规范CTC检测在临床诊疗中的合理应用，中华医学会检验医学分会分子诊断学组针对上述 问题广泛征集检验、病理、临床和基础研究专家的 意见并形成共识。专家组后续将根据相关领域的 研究进展适时修订此共识，以适应临床应用的最新 需求。本共识主要分为CTC 的临床应用及前景、CTC 检测技术发展迅速，其在肿瘤临床诊疗中的应用价值也越来越受关注，但目前尚无统一的CTC 检测技术行业标准和应用指南，业界对该技术的临床适用场景、检测流程及质量管理等方面仍有 困惑。为规范CTC 检测在临床诊疗中的合理应用，中华医学会检验医学分会分子诊断学组针对上述 问题广泛征集检验、病理、临床和基础研究专家的 意见并形成共识。专家组后续将根据相关领域的 研究进展适时修订此共识，以适应临床应用的最新 需求。本共识主要分为CTC 的临床应用及前景、CTC 实验室检测技术与质量管理两大部分。

 

 

 

 

CTC 的临床应用及前景

 

1869 年病理学家John Ashworth 首次在转移性癌症患者血液中发现与原发肿瘤相似的肿瘤细胞， 并提出循环肿瘤细胞的概念。随着生物医学技术的发展，CTC 检测的内涵不断丰富，针对CTC 数量、分子分型、下游应用及单细胞特征的分析，在肿瘤 精准诊疗中的应用受到越来越多关注。

一、CTC 计数的临床应用

大量临床研究表明CTC 计数在多种肿瘤的疗效评价和预后评估中有重要价值。例如，与基线CTC<5 个/7.5 ml 全血的转移性乳腺癌患者相比，CTC≥5 个/7.5 ml 全血的患者在内分泌治疗和化疗后 中 位 无 进 展 生 存 期［progression‑free survival（PFS）：7.0 个月比 2.7 个月］和总生存期［overall短（15.1 个月比27.1 个月，HR=3.4，P<0.001）［11］。 美国食品药品监督管理局已批准CTC 计数用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后评估（CellSearch 法®），其提示不良预后的CTC 预测值分别为5、5、3 个/7.5 ml 全血）。多项肿瘤诊疗指南和专家共识也纳入了CTC 在肿瘤疗效评价和预后评估中的应用，包括中国临床肿瘤学会（CSCO）乳腺癌诊疗指南（2019 年版）［12］、原发性肝癌诊疗规范（2019 年版）［13］、肝细胞癌生物标志物检测及应用专家共识［14］、循环肿瘤细胞检测在结直肠癌中的应用专家共识（2018）［15］、液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识［16］等。值得注意的是，由于CTC 检测方法众多，实际应用时应结合具体肿瘤类型和所选检测方法确定合适的疗效评价和预后评估阈值。

 

此外，美国癌症联合委员会在 AJCC 肿瘤分期手册（2010‑v7 版和 2018‑v8 版）中新增了以 CTC 为依据的cM0（i+）分期，提示CTC 在肿瘤转移和分期中的重要作用。cM0（i+）分期定义为临床未出现转 移症状和影像学转移证据的M0 期（cM0）患者在外周血中检出CTC、或在骨髓、淋巴结中检出肿瘤细 胞［17‑18］。研究表明 CTC 数量与乳腺癌、前列腺癌、

surviva（l OS）：18.0 个月比 10.1 个月］较短［3］。一项针对 6 825 例乳腺癌患者的荟萃分析表明，CTC 计数 对 早 期 乳 腺 癌［PFS：HR=2.86（95%CI 2.19~ 3.75）；OS：HR=2.78（95%CI 2.22~3.48）］和转移性乳腺 癌（PFS：HR=1.78，95%CI1.52~2.09；OS：HR=2.33，95%CI 2.09~2.60）均有良好的预后价值［4］。联合基线/治疗后CTC 数量和其他临床病理指标可提高乳腺癌预后预测的准确性［5］。CTC 计数对前列腺癌［6］、结直肠癌［7］、肝癌［8］等肿瘤的疗效评价和预 后价值也在多中心临床研究中得到证实。此外，CTC 数量的动态变化在提示疾病进展和治疗效果方面有重要价值。研究表明，肝移植术前 CTC 阴性、术后CTC 升高的肝癌患者与术前CTC 阳性、术后CTC 阴性的患者相比复发风险较高（49.2% 比22.1%）［9］。在转移性前列腺癌的前瞻性、随机、多中心临床Ⅲ期研究（n=6 081）中发现，基线 CTC≥1 个/7.5 ml 全血、治疗 13 周后 CTC<1 个/7.5 ml 全血）与前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）反应率（PSA 下降 30%、50% 和 70%）比较，具有更准确的疗效评价能力［10］；而“CTC 进展”（基线CTC<5 个/7.5 ml 全血、治疗后 CTC≥5 个/7.5 ml 全血）患者较未发生 CTC 进展的患者中位OS 明显缩肺癌等肿瘤的临床病理特征显著相关（如肿瘤大 小、分期、转移等），基线CTC 数量升高提示较差的肿瘤临床病理特征［19‑21］。CTC 数量检测可辅助肺部良恶性结节的鉴别诊断，且可作为术前评估肺腺癌 侵袭性的独立因素，从而指导手术方式的选择［22］。同时，联合CTC 计数和影像学特征、病理学评分或血清学肿瘤标志物有助于提高肿瘤转移诊断的准 确性［23‑25］。但相比于转移性肿瘤患者，早期肿瘤患者中CTC 的检出率较低［26］，因此CTC 计数直接用于肿瘤早期诊断的敏感度较低［27］。

共识1：CTC 计数可用于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌等实体肿瘤的疗效评价和预后评估， 应结合具体肿瘤类型和CTC 检测方法选择合适的判断阈值；追踪手术前后或综合治疗过程中 CTC 的动态变化可为肿瘤疗效评价和预后评估提供实 时监测信息。

共识2：CTC 计数可提示肿瘤转移风险和辅助肿瘤分期，联合 CTC 计数和影像学、病理学、血清学特征参数有助于更准确地评估肿瘤状态和疾病进展；不建议单独以 CTC 计数作为肿瘤早期筛查和诊断的工具。

二、CTC 分子分型的临床应用

 

随着对CTC 认识的深入和临床应用需求的发展，CTC 检测逐步从单纯细胞计数发展为细胞计数结合分子分型的综合分析。CTC 是异质性的细胞群体，针对 CTC 的蛋白、DNA、RNA 分子水平的分型分析可以表征肿瘤进化和治疗过程中的生物学特征，从而为全面评估肿瘤状态、精准制定治疗方案提供重要的实时信息。CTC 分子分型主要包括疗效预测标志物分型、上皮‑间质转化分型、功能特性分型等。疗效预测标志物分型：前瞻性、多中心临床研究表明 CTC‑雄激素受体变异体 7（androgen receptor variant 7，ARV7）阳性与转移性去势抵抗前列 腺 癌 （metastatic castration resistant prostatecancer，mCRPC）新型内分泌治疗（阿比特龙/恩杂 鲁胺）耐药有关，基线CTC‑ARV7 阳性与mCRPC 新型内分泌治疗后更短的 PFS 及 OS 独立相关［28］；

 

CTC‑ARV7 阳性患者更易从紫杉烷化疗中获益，而CTC‑ARV7 阴性患者接受新型内分泌治疗的生存期优于接受紫衫烷化疗（中位 OS：19.8 个月比12.8 个月）［29］。 因此 ，美 国国家综合癌症网络（national comprehensive cancer network，NCCN）前列腺癌指南（2019‑v2 版）推荐CTC‑ARV7 检测用于辅助mCRPC  新型内分泌治疗方案的选择［30］。

 

人 表 皮 因 子 生 长 受 体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是乳腺癌靶向药的疗效预测标志物。CTC 与肿瘤组织HER2 表达存在异质性，研究表明，组织 HER2 表达阴性、但HER2+CTC 数量升高的转移性乳腺癌患者仍能从HER2 靶向治疗中获益；治疗后 HER2+CTC 数量下降（<2 个/7.5 ml 全血）患者的 PFS 较HER2+CTC 持续 ≥2 个/7.5 ml 全 血 患 者 显 著 延 长（11.7 周 比2.0 周）［31］。此外，CTC 与原发肿瘤的雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesteronereceptor，PR）表达也不完全一致，CTC 中ER 或PR表达降低可能导致乳腺癌患者内分泌治疗效果不佳。因此，CTC 的HER2、ER、PR 分型可为晚期乳腺癌疾病进展时的治疗决策优化提供实时参考信息。 其他常见 CTC 疗效预测标志物分型包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA 基 因 突 变 、ALK、ROS1 基因重排等［32］，根据其在 CTC 中的表达可辅助预判相应靶向药的疗效，从而提供用药指导。

 

PD‑1/PD‑L1 免疫检查点抑制剂近年来发展迅速，肿瘤细胞PD‑L1 表达可预测其疗效。肿瘤组织

PD‑L1 检测阳性率低、受时间和空间异质性影响较大，CTC 的PD‑L1 分型检测有望成为实时监测免疫治疗反应的替代方案。研究表明，晚期非小细胞肺癌患者CTC 的PD‑L1 阳性检出率显著高于肿瘤组织（83% 比 41%）［33］。 与 阴 性 患 者 相 比 ，检 出PD‑L1 阳性 CTC 的肺癌患者术后无瘤生存期（disease‑free survival，DFS）较 短（24.5 个 月 比16.7 个月）［34］。基线时高表达PD‑L1 的CTC 水平可作为筛选患者进行PD‑1/PD‑L1 阻断疗法的预测因子，高表达PD‑L1 CTC 组患者的疾病控制率远高于低 表 达 PD‑L1 CTC 组（64% 比 14%），且 检 测PD‑L1 阳性CTC 的动态变化可以指示早期治疗效果［35］。CTC 中PD‑L1 分型与肿瘤组织PD‑L1 表达差异的分子机制及其在肝癌等其他肿瘤类型中的应用价值仍有待进一步研究。

 

上 皮‑间 质 转 化 分 型 ：上 皮‑间 质 转 化（epithelial‑mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键生物学过程，EMT 在CTC 的产生、释放和转移灶的形成中发挥重要作用。CTC 上皮标志物表达在EMT 过程中会发生下调、甚至消失，根据EMT 标志物的表达可将CTC 分为上皮型［表达 E 钙黏着蛋白、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）等］、间质型CTC（表达N 钙黏着蛋白、波形蛋白、snail 蛋白等）、混合型CTC（同时表达上皮和间质标志物）。一项大样本中国结直肠癌临床研究纳入 1 203 例不同分期的结直肠癌患者，发现混合型CTC 和间质型CTC 数量随肿瘤进展显著增加（间质型CTC 在非转移、淋巴结转移和远处转移患者中的检出率分别为 45.8%、67.1% 和72.3%）［36］，表明 CTC‑EMT 分型可提示结直肠癌转移和辅助临床分期。有研究证实肝癌CTC 从原发病灶脱落进入外周静脉时发生EMT 过程，且 CTC 分子表型的时空异质性与肝癌患者术后肝内复发及肺转移密切相关［37］。与术前 CTC 数量低、间质型/混合型CTC 阴性的肝癌患者相比，术前 CTC 数量高、间质型/混合型 CTC 阳性的患者肝切除术后DFS 较短（36 个月比 16 个月），且肝外转移较多（28.2% 比 60.5%）［38‑39］；提示 CTC 的EMT 分型有助于术前治疗效果评估和辅助手术方式决策。间质型CTC 对乳腺癌［40］、前列腺癌［41］、肺癌［42］等肿瘤疗效评价和预后的应用价值均有临床研究报道。

 

功能特性分型：肿瘤细胞具有无限增殖和能量代谢异常等生物学特点，依据肿瘤细胞区别于正常细胞的功能特性进行CTC 分型有助于鉴定CTC

的生物学活性和转归，从而为肿瘤的病情评估和病程监测提供更丰富的信息。肿瘤干细胞与肿瘤进展密切相关，通过肿瘤干性标志物可筛选恶性程度高的CTC 亚型。最近有研究表明高表达肿瘤干性标志物八聚体结合转录因 子（octamer‑binding transcription factor 4，OCT4）的CTC 亚型在肌层浸润型膀胱癌中的阳性率显著高于非肌层浸润型膀胱癌（65.2% 比 32.1%）［43］。约 75% 肺癌患者可检出OCT4 阳性CTC，高表达OCT4 的CTC 亚型更易出现在晚期和转移性肺癌患者［44］。其他肿瘤干性标志物如CD133、CD44 阳性的CTC 亚型也被发现与乳腺癌、肝癌等肿瘤的转移风险、化疗耐药和不良预后密切相关［45‑46］。

 

代谢重编程在促进肿瘤转移中发挥关键作用， 肿瘤细胞的代谢特征可为CTC 功能分型提供新思路。基于糖代谢标志物（磷酸甘油酸激酶 1/葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶）的 CTC 分型在提示前列腺癌远处转移方面具有重要价值，联合高代谢型 CTC 和tPSA、Gleason 评分可有效辅助诊断前列腺癌转移（受试者工作特征曲线下面积为0.904）［25］。CTC 糖代谢分型可提高乳腺癌远处转移诊断的特异性（高代谢型 CTC 91.3%，CTC 总数 71.8%），且高代谢CTC 升高提示患者PFS 缩短，表明CTC 糖代谢分型可作为乳腺癌转移和预后的生物标志物［47］。也有学者研究了 CTC 脂代谢标志物半乳糖苷酶（galactose cerebroside，GALC）分型与肺癌进展与预后的相关性，发现80.6% 的非小细胞肺癌患者可检出GALC 阳性CTC，且术后发生转移患者检测阳性率明显高于未转移患者（100% 比 68%）［48］。目前CTC 功能特性分型研究仍处于探索阶段，从研究到应用的转化还需要更充分的临床研究证据支持。

 

共识3：CTC 分子分型可为全面评估肿瘤状态和肿瘤精准诊疗提供重要的实时信息；基于治疗靶 标的CTC 分型分析有助于提示药物疗效从而指导治疗决策 ，如 ARV7（前 列腺癌内分泌治疗）、HER‑2/EGFR/KRAS（靶向用药）、PD‑L1（免疫治  疗）等。

 

共识 4：CTC‑EMT 分型的临床应用价值在多种肿瘤类型研究中得到证实，结合 CTC 计数和EMT 分型及其动态变化可辅助肿瘤分期、复发风险评估及预后预测；针对肿瘤细胞干性和代谢特征的CTC 功能分型有助于反映CTC 的生物学转归和疾病的发展，是未来泛癌种 CTC 分子分型发展的前沿方向。

三、CTC 存在形式分析的临床应用

CTC 可能以单个细胞、CTC 簇、CTC 与其他血液成分聚集成团等形式存在于血液循环中。由于 富集过程中细胞团被破坏或CTC 抗原表位被隐藏， 大多数CTC 富集设备可能难以检出CTC 细胞团。研究表明，尽管这些以细胞团形式存在的CTC 亚型相对少见，但其转移潜能远大于单个 CTC（20~50 倍）［49‑50］。CTC 与白细胞、血小板、巨噬细胞等聚集成团对调节血液微环境、建立新的转移灶有重要意义，例如中性粒细胞可通过细胞间黏附分子‑1 与CTC 结合，增强CTC 对自然杀伤细胞的免疫杀伤抵抗，从而促进 CTC 的免疫逃逸［51］；血小板与 CTC 结合有助于CTC 抵抗物理剪切和免疫杀伤，并且血小板可释放可溶性介质诱导CTC 对内皮细胞的黏附和向组织内迁移，进而促进肿瘤转移［52］。

 

物理学分离方法由于不依赖特定标志物，比生 物学分选方法更易检出CTC 细胞团［53］。有研究通过基于物理特征分离的富集技术（膜过滤方法）在 乳腺癌患者有效检出CTC‑白细胞团（CTC‑WBC）。与 CTC 数量≥5 个/7.5 ml 全血患者相比 ，检 出CTC‑WBC 患者的PFS 较短［50］；且 CTC‑WBC 的EMT表型可提示乳腺癌骨转移、淋巴结转移的风险及不良预后［54］。此外，CTC‑WBC 数量与肝癌的肿瘤大小和数量、脉管癌栓、BCLC 分期、AFP 水平和CTC 总数相关，并可独立预测肝癌患者 DFS 和OS［55］。

 

CTC 细胞团的形成影响了局部的肿瘤转移微环境， 其对肿瘤转移和疾病进展的提示意义优于单个CTC，但由于其数量比 CTC 更少，CTC 细胞团在更多肿瘤中的应用价值仍有待进一步研究。

 

共识5：CTC 有多种存在形式，包括单个细胞、CTC 簇或CTC 与其他血液成分（白细胞、血小板、巨噬细胞等）聚集成团，CTC 细胞团检出率的提高有赖于检测方法的进一步优化；分析 CTC 的存在形式有助于揭示CTC 与循环中血细胞、免疫细胞的相互作用，阐明 CTC 免疫逃逸和转移播散的机制，是CTC 检测领域重要的探索方向。

四、CTC 下游分析的临床应用

CTC 携带肿瘤细胞的丰富分子信息，CTC 下游分析（CTC 体外培养、单细胞测序等）具有广阔的应用前景。近年来已有文献报道成功建立乳腺癌、结直肠癌、肺癌的 CTC 细胞系［56‑58］。CTC 体外培养可扩增血液中稀有肿瘤细胞的数量，通过PCR 等技术分析CTC 细胞系中肿瘤驱动基因和药物靶点基因的表达，可为肿瘤发生机制研究和临床用药提供指

 

导信息。此外，利用CTC 细胞系构建人源肿瘤异种移植模型进行转移靶器官预测和药敏实验［59］对揭示肿瘤转移机制和耐药机制具有重要意义，有助于推动肿瘤个体化治疗的发展。

 

由CTC 群体分析走向单细胞分析是肿瘤精准诊疗时代下CTC 检测的发展趋势。高通量测序研究表明，CTC 携带的基因突变信息与非小细胞肺癌患者原发灶肿瘤细胞的基因信息一致性为79%，但与该患者10 个月后出现的转移灶肿瘤细胞的基因突变信息一致性达91%，提示CTC 的单细胞高通量测序可提供更准确的肿瘤进展和转移信息［60］。

 

分析CTC 的单细胞突变图谱和拷贝数变异模式对疗效预测和预后评估有重要价值［61‑62］，如与CTC 突变率高的小细胞肺癌患者相比，CTC 突变率低的患者化疗后PFS 及OS 显著延长［61］。此外，通过 CTC 单细胞测序有可能提前获得转移灶的基因信息、发现新的耐药机制和治疗靶点［59，63］。目前，由于CTC 数量稀少、检测过程中细胞活性容易受损等因素导致CTC 单细胞测序的技术要求较高，限制了CTC 单细胞测序的扩大应用。随着分析技术的不断进步和更多临床研究的探索，未来CTC 单细胞分析的应用前景将更为广阔。

 

共识 6：CTC 体外培养、单细胞测序等下游分析是CTC 检测领域的前沿方向，也是精准医学时代CTC 临床应用的重要趋势；未来CTC 检测技术的进步应着重突破CTC 单细胞测序的瓶颈问题， 探索单细胞CTC 高保真核酸扩增及文库构建等创新技术，以促进CTC 单细胞分析的发展和应用。

 

CTC 实验室检测技术与质量管理

 

CTC 具有数量稀少［血液中CTC 与有核细胞数量比值为 1∶（105~107）］［64］、半衰期短（1~2.4 h）、存在多种亚型等特点，为 CTC 实验室检测带来了挑战。准确可靠的CTC 检测结果需要系统性、标准化的质量管理体系来保障。本部分主要讨论CTC 检测技术（分离与富集技术、鉴定与分析技术）的原理、特点及质量管理。

一、CTC 检测技术

（一）CTC 分离与富集

CTC 检测的一般策略包括CTC 分离与富集、鉴定及下游分析。CTC 分离与富集是指将CTC 与血细胞和其他血液成分有效分离的过程。文献报道及目前国内检测公司提供的技术平台很多，根据其技术原理主要分为依赖特定标志物的生物分选法 和不依赖特定标志物的物理分离法两大类［65‑66］。生物学分选将特定标志物抗体或核酸适配体等附 着至微柱、微孔或磁性设备，通过抗原抗体结合原 理实现CTC 分离与富集，可分为阳性富集和阴性富集两种。阳性富集法主要通过CTC 捕获抗体正向富集CTC，该方法富集纯度较高，但由于 CTC 具有异质性，这类方法可能导致部分CTC 的漏检，例如依赖 EpCAM  抗体磁珠的富集方法难以捕获EpCAM 表达下调甚至消失（发生EMT 时）的CTC 亚群［67］。目前尚无普适性的肿瘤细胞标志物，因此难以避免CTC 漏检现象。选择肿瘤类型特异的标志物抗 体（如 前列腺癌 PSA、乳 腺癌 HER2、肺 癌MUC1 等）［65］或采用多种抗体复合物有助于提升富集效率［53］。阴性富集法主要采用 CD45 和CD61 去除白细胞、巨噬细胞和血小板实现负向筛选，可降低CTC 抗原表达下调或消失导致的检测假阴性风险［53］。但该方法分离纯度相对较低，对后续CTC 鉴定与分析技术灵敏度和特异度的要求较高。

 

物理学分离方法是指通过CTC 区别于其他细胞的物理学特征如大小、密度、力学及电学特征等 进行CTC 分离和富集。基于细胞大小分离是指根据CTC 体积显著大于白细胞的特点、采用固定孔径的滤膜进行分离。密度梯度离心法根据CTC 与白细胞密度及体积等沉降系数差异对CTC 进行分离。电学特征分离法根据电荷、导电性等特征差异进行CTC 分离与富集。微芯片法主要截留体积更大、不易变形的CTC，微流控法利用特定条件下不同细胞大小、密度、变形性等流体力学差异进行CTC 富集。物理学分离的优势是不依赖特定标志物，有利于检 出抗原表达异质型CTC 和抗原未知的CTC 亚型，但也可能存在分离纯度较低、容易漏检部分体积较小 的肿瘤细胞等不足［65］。

 

不同技术方法各有其特点和局限性［65‑66（］ 表1），实验室应结合应用目的和后续鉴定与分析的要求 选择合适的方法，例如小细胞肺癌CTC 分析时避免选用常规的基于细胞大小分离的方法、当后续分析 对细胞活性要求较高时避免选用需要固定细胞的 富集方法等。也有技术同时结合生物分选和物理 分离两种原理，以期提高CTC 分离富集的效率和纯度，但同时可能带来处理时间延长、步骤繁多等问 题，增大了其在临床实验室应用的难度，未来仍需 发展更多简便、高效的CTC 分离富集创新技术。

 

共识 7：不同 CTC 分离与富集技术各有优缺点，实验室应结合应用目的和后续鉴定与分析的要求选择合适的方法；实验室应在充分评估所选方法的检测效能的基础上开展CTC 分离与富集。

 

 

 

（二）CTC 鉴定与分析

解析CTC 的形态、功能、分子表达等特征。富集分离后可利用蛋白质、RNA、DNA 表达差异以及肿瘤细胞功能差异对CTC 进行鉴定与分析。

 

在蛋白层面主要利用适配体或抗体检测肿瘤细胞中的特异蛋白，如采用适配体技术和靶向PCR 检测肿瘤细胞表面叶酸受体的表达可间接反映CTC 的水平，具有高回收率和高敏感性的优势［21］， 是国家药品监督管理局批准的首个肺癌CTC 检测方法。免疫荧光法通常采用上皮细胞特异性CK 抗体（CK8、CK18、CK19）、白细胞抗原CD45 抗体和核染料DAPI 标记CTC，CK 阳性、DAPI 阳性、CD45 阴性，且细胞较大、形态完整的细胞被判别为 CTC。但由于良性上皮细胞也可能呈CK 阳性［68］，该方法可能出现假阳性结果。此外，EMT 可引起抗原表达水平降低，使用单一抗体可能影响检测灵敏度。应 根据癌症类型优化检测蛋白标志物的选择，同时采 用阴阳性对照有利于提升免疫荧光法的检测特异 性和灵敏度。流式细胞术则通过特异性抗体靶向 肿瘤细胞进行快速检测，可同时实现多通道检测， 但其灵敏度较低，且需要大量待分析细胞［69］。

 

在RNA 层面可利用荧光定量PCR、RNA‑荧光原位杂交等技术分析CTC 的mRNA 及微小RNA 的表达。荧光定量PCR 法是基于基因转录水平对细胞进行鉴定的方法，根据肿瘤类型选择不同核酸组合方式对多个基因标志物进行检测，可显著提高CTC 的检测灵敏度［70］。在 DNA 层面上，不同于免疫荧光法易受CTC 抗原表达量异质性的影响，基于染色体核型异常鉴定CTC 的荧光原位杂交法可检出CK 和EpCAM 表达下调的CTC 类型［71］，但需注意肿瘤细胞染色体拷贝数分布具有异质性，且良性血管内皮细胞也可能出现染色体核型异常，应根据癌症类型采用特定探针组合以提高检测准确性。也可利用靶向PCR、DNA 测序等分析CTC 的基因突变，如二代测序技术可检出未知突变；单细胞测序技术在克服CTC 异质性方面有明显的优势，通过单细胞水平的CTC 全基因组分析有助于揭示肿瘤转移及耐药的分子机制［72］。但 CTC 测序分析方法对设备及人员的要求较高，目前仍有待技术进一步完善以适应临床需求。

此外，一些基于肿瘤细胞功能学差异（分泌功 能、代谢功能等）的新技术能够在不损伤CTC 的情况下实现CTC 的鉴定与分析。这类方法可避免由细胞固定、染色、杂交等处理导致的细胞结构及成 分的破坏，可满足CTC 下游分析和应用对细胞活性的要求，成为CTC 检测分析的新方向。上皮免疫斑点法通过检测活的肿瘤细胞特异分泌的抗体或细 胞因子，可在单细胞水平上检测有活性的 CTC［73］。利用CTC 线粒体活跃的特点设计聚集诱导发光荧光探针可标记代谢活跃的活性CTC，从而实现CTC的无损鉴定［74］。利用肿瘤细胞糖代谢特征（葡萄糖 高摄取、关键代谢酶HK2 活性高）可实现高通量的CTC 鉴定与单细胞分析［75‑76］。利用针对CTC 膜蛋白的抗体或适配体并结合可在温和的生理条件下运行的核酸等温扩增技术，可实现CTC 的无损定量分析［77‑78］。但目前不同鉴定及分析方法的结果表述方式不尽相同，检测结果之间难以相互比较，实验室在开展检测前应进行充分的性能评估。

共识8：CTC 鉴定与分析技术的选择应综合考虑上游分离富集技术的特点和下游应用的目的，根据肿瘤类型选择合适的标志物可提高CTC 检测的准确性，结合细胞功能特征分析可丰富 CTC 检测的层次以适应临床诊疗的多种需求；实验室应在充分评估所选方法分析性能的基础上进行CTC 鉴定与分析。

二、CTC 实验室检测的质量管理

 

（一）分析系统性能验证

实验室对CTC 检测过程中所需试剂和耗材的选择，应首先考虑经国家药品监督管理局医疗器械注册/备案的试剂与耗材，以确保符合临床要求；同时也应兼顾其与检测设备的兼容性，以确保符合检测要求。所选的分析系统使用前必须依照说明书完成相关的性能验证，验证参数（针对CTC 分离与富集、鉴定及分析的检测全流程）包括但不限于回收率、检测限、精密度等，并制定标准实验操作流程（standard operation procedure，SOP），以减少不规范的实验操作对结果的影响。目前国内外尚无权威的  CTC 性 能 验 证 指 南 ， 本 部 分 参 考《CNAS‑GL039 分子诊断检验程序性能验证指南》［79］列举部分性能参数进行说明。

回收率：通常可利用细胞掺入实验测定CTC 分析系统的回收率及检测限［80‑81］。根据拟开展检测的肿瘤类型，选择适宜的肿瘤细胞系进行荧光预标记，计数一定数量的细胞（根据具体肿瘤类型和分析系统的检测范围确定）加入健康人静脉血作为模拟血样，重复检测 3~5 次，计算检测的细胞数占掺入细胞数的百分比即为回收率。

检测限：将拟开展检测的肿瘤类型对应的肿瘤细胞系预标记荧光，制成系列浓度梯度（结合说明书提供的检测范围设定）的细胞悬液分别加入健康人静脉血作为模拟血样，通过检测的肿瘤细胞数量评估分析系统的检测范围和检测限。

精密度：将开展检测的对应工具细胞预先染色，根据方法的检测范围制备已知数量（高、中、低浓度）的多份细胞悬液冻存。每次检测时取一份细胞悬液加入健康人静脉血中，制成高、中、低浓度的模拟血样，重复检测各浓度模拟血样 10~20 次，或连续检测各浓度模拟血样 10~20 d，评估检测系统的批内和批间精密度。

分析系统的性能参数应达到厂家说明书提供的标准，根据文献报道和实验室调研，CTC 分析性能验证时常用的肿瘤细胞系如表2 所示，实验室应根据采用的检测技术和拟开展应用的肿瘤类型选择理化性质相似的细胞系进行性能验证。必要时（如涉及实验室自建方法或操作流程时）还应根据 混合型        HeLa、HEK 293、A549、PC‑3        实验室自建项目的相关要求进行其他的性能参数确认（如标本稳定性、试剂稳定性等）［82］。根据CTC检测方法的不同特点可选择不同的性能验证或确认的参数，实验室可根据实际情况确定所需的最小样本数。

此外，实验室在引进性能验证合格的CTC 分析系统后，还应在实际开展CTC 检测项目之前进行临床应用前评估（如 CTC 检测在不同人群中的阳性率、CTC 临床参考范围及截断值等）。由于各实验室使用的检测方法、拟开展的肿瘤类型及应用场景不尽相同，目前尚无法确定统一的CTC 参考范围和截断值，建议实验室参考针对同方法、同癌种的大型临床研究报道的结果，并设计相关的临床试验确定本实验室适用的CTC 参考范围和截断值。行业内专业委员会可制订相应的临床研究计划，推动各实验室开展大规模、多中心临床研究，以明确同一

CTC 检测方法在同一肿瘤特定场景应用的参考范围和最佳截断值。

 

共识9：实验室开展CTC 检测前应对所选分析系统进行性能验证，属于实验室自建方法的分析系统还应根据相关要求进行其他参数的性能确认；应注意所选CTC 分析系统的适用范围，跨癌种应用时应考虑到不同起源、不同病理类型肿瘤细胞的理化性质不尽相同，须进行充分的性能验证和临床观察研究。

 

（二）分析前质量管理

良好的分析前质量管理是保障检测结果准确的前提条件。CTC 检测分析前质量管理主要涉及样本采集（患者准备、采集要求等）、预处理、保存和运输（时间和温度）等。分析前 SOP 应涵盖样本采集、预处理、保存和运输过程的系列标准操作，并对质控变量进行充分的说明和解释。

样本采集：CTC 样本采集的质控变量应实现

 

标准化，其内容应包括但不局限于：采血时间、是否禁食、采血时患者体位、采血管类型及抗凝物质要求、采血部位、采血量等［83］。常见的采血管类型包括EDTA‑K2 抗凝管、CellSave 抗凝管、cfDNA/RNA 保存BCT 管、ACD 采血管等，不同采血管对CTC 保存的时效和稳定性不尽相同［84‑85］。有研究表明CellSave 管用于CTC 计数和染色分析时可使血液在室温下保存 72~96 h［86］；CTC‑ARV7 转录物（数字PCR 分析）在 EDTA‑K2 或ACD 抗凝血液中可稳定48 h，但 BCT 管中的mRNA 在采血后显著降低且48 h 后无法测出［87］。建议优先选择检测方法配套或推荐的采血管，无明确指定时可根据检测目的、检测时长和保存剂的特点进行选择，例如需要对CTC 进 行 计 数 和 形 态 分 析 时 可 选 用 常 规EDTA‑K2 或CellSave 管、需要进行 CTC 分子分析时可选用核酸保护效果较好的ACD 管等［84‑85］。

外周静脉血是目前最常用的CTC 检测样本类型，建议常规采集流程为：肘部静脉穿刺采集外周血5~20 m（l 采血量视检测方法的要求而定）。采血后立即轻柔颠倒 8~10 次混匀，防止凝血。需注意的是循环系统中不同部位CTC 之间存在明显的细胞分布和生物学特征的空间异质性。研究发现，从肝癌患者外周静脉、外周动脉、肝静脉、肝下下腔静脉和门静脉采血检测的CTC 数量、EMT 表型和CTC 细胞团各有特点，且其在提示肝癌术后肺转移和肝内复发方面的临床价值也不尽相同［37］。临床医生可根据患者治疗周期、治疗方案、研究目的等实际情况选择相应的采血部位和采血时间点，但建议治疗或研究的全过程中样本采集条件相对固定，以便于后续结果的解释。

样本预处理、保存及运输：应采用标准化试剂盒对CTC 样本进行预处理，并对样本预处理、保存和运输过程中质控变量的变异范围进行有效追 踪和管理［85］。应严格按照相关操作规范执行操作， 有效保障标本接收时的质量。一般建议血液采集 完毕后立即送检，不能立即送检的标本应低温保存

（2~8 ℃），4 h 内转移至检测实验室进行检测。到达实验室后，应检查样本是否存在凝血、脂血等异常情况，对不合格样本应拒收，不能及时检测的样本应根据检测目的和采血管特点严格控制样本储存条件（时间、温度）。

 

（三）分析中的质量管理

分析中的质量管理是CTC 实验室检测质控的核心环节。建议在CTC 分离与富集、鉴定及分析的全过程均引入标准化检测设备和配套软件，并建立 完善的标准操作程序和检测人员的资质管理制度， 健全实验室质控体系，充分保障检测结果的准确性。

人员培训与考核：实验室应配置相关专业背景的技术人员，经理论和操作实践的培训与考核后方可开展CTC 项目检测。操作人员严格遵循检验设备及试剂的质量管理体系是检测结果可靠准确的有效保障。应定期开展操作人员的项目操作技能考核，包括但不限于自动化检测设备的使用与维护、试剂与耗材的标准操作规范、质控相关标准操作步骤的实施等，其中不同操作人员间对CTC 检测图像的判断可能存在较大差异，应定期根据典型和非典型CTC 检测图谱开展人员能力比对，以提高检测结果准确性。另外，利用整合人工智能图像识别工具的全自动CTC 分离及鉴定系统［88］有助于减少人员间的操作误差。

试剂/耗材质检和设备维护：CTC 检测步骤较多，应制定标准化程序对检测过程中涉及到的试 剂和耗材进行质检，包括包装检查（包装是否完整、标识是否清楚、保存条件和有效期是否明确等）和 可能影响检测结果的关键性能参数检查（依检测方 法的原理和操作而定，例如荧光探针/抗体的有效 性和批间一致性、滤膜的孔径大小和滤过效率、吸 头的气密性/准确性/携带污染源等）。此外，使用过 程中应定期监测和记录试剂/耗材的保存温度和有 效期，并定期对所用的仪器设备做维护和保养以充 分保障其性能稳定。

室内与室间质控：检验项目应设立合理的室内质控以监测样本检测的全部流程，但目前尚无公 认适宜的CTC 实验室检测全程质控物。考虑到不同CTC 检测平台应用的仪器设备和试剂各异，应根据不同检测平台的关键步骤分别设立合理的质控 或定期对使用的设备及试剂耗材进行性能评估。如分离富集CTC 的过程中，对于微流控芯片法，应注意监控泵的流速控制和每批芯片的均一性；对于 膜过滤法，应充分考虑到负压泵的稳定性、滤过膜 孔径的大小和均一性等。CTC 鉴定的过程中，应监控不同标记探针或抗体及杂交试剂的质量等。

虽然目前没有商品化的CTC 检测全程质控品， 但对有些步骤建议技术厂家也能提供适宜的参考 品。例如预制备的肿瘤细胞与白细胞混合细胞甩 片，可用于评估鉴定试剂性能及技术人员的图像识 别能力。同时，行业内专业委员会可制定CTC 检测

参考物质的研发计划，联合相关企业积极推动CTC 质控物的开发和商品化。例如，Tommasi 团队的实验室利用肿瘤细胞系掺入健康人血样中构建不同浓度的参考品，在采用相同检测系统的多个实验室开展长期、系统的性能验证和评估后作为CTC 室内质控品使用［81］。实验室质控品的构建应注意符合临床样本的模拟度（肿瘤细胞类型、大小及分子特性等），同时保证性能稳定且数量充足，以满足长时间检测分析的要求。质控品的制备建议由固定的专业人员，在固定的实验区域培养、配制和分装，以减少人为误差，避免受到临床样本的污染。

实验室可根据CTC 检测项目和检测平台制定相应的可接受的质控标准。如果质控品的结果与预期不相符，需分析失控原因并保存相应记录，同时提出有效的纠正措施和预防措施。另外，基于患者的实时质量控制（patient‑based real‑time qualitycontrol，PBRTQC）可通过来自患者样本的数据，在日常检测的同时实时监测检测系统状态［89‑90］。浮 动均值法是常用方法之一，通过定期对比患者CTC 检测数据的均值与靶值及控制极限值的偏离情况， 可有效辅助判断检验实验室的项目运行是否在控。各检测实验室可考虑根据积累的检测数据建立适 用于本实验室CTC 检测的PBRTQC 方法，并作为实验室质控体系的一部分。

采用相同检测系统的实验室应定期开展室间质控活动，对相同的工具细胞系或同一患者来源的 生物学标本开展检测对比。由于目前开展的CTC 检测项目有限，实验室间质控更多采用实验室间比 对及替代方法的方式解决。比对应至少每年1 次， 比对样品的数量至少 3 份，包括阴性、低浓度和高浓度水平。当实验室间比对无法开展时，可采用其 他替代方法，如标本的盲法重检、与其他方法比较 或临床相关性分析判断检测结果的可接受性。

（四）分析后的质量管理

分析后的质量管理是全程质控的最后一个环节，也是促进检验工作更好地服务临床的重要保 障。CTC 检测的分析后质量管理主要包括检测结果确认、报告发放，以及临床沟通和咨询服务。

 

CTC 检测结果确认应注意再次检查标本质量是否符合要求、检测过程中仪器设备是否运转正常、质控是否在可接受范围内、是否有干扰检测结果的因素、CTC 结果与患者的临床病情或关联的检验参数之间是否存在不可解释的现象等。必要时应对异常结果或疑难结果复查之后才可发放结果。

 

CTC 检测报告建议包含但不限于如下内容：患者一般信息、临床诊断、样本信息（采样部位、采样时间和检测时间）、方法学描述、CTC 检测结果（包含但不限于细胞图像、细胞计数、分子分型、历史结果等）、必要的截断值、局限性说明等。建议采用同种检测方法的不同实验室发放CTC 的报告内容保持一致，以增加实验室间结果的可比性。有效的报告解读与临床沟通是实现CTC 临床应用的必要条件。CTC 检测报告解读时应综合考虑分析前和分析中各个环节可能的影响因素，并紧密联系患者的临床病情；建议有条件的实验室可以在报告中同时纳入检验医师或临床医师对检测结果临床意义解读的指导性意见。临床沟通工作应对检测结果、质量体系、结果的临床符合性做充分说明，对临床应用中出现的疑难问题从方法性能和临床肿瘤学角度做好客观、详细的解释与沟通。

共识 10：严格的质量管理是保证 CTC 检测结果准确、可靠的关键。实验室应针对 CTC 检测的各个关键环节，建立完善的质量管理体系以规范分析前、分析中及分析后的操作流程，并做好检测结果解读与临床沟通工作，以保障 CTC 临床应用的有效性及实用性。

 

 

 

 

执笔人：蔡贞（南方医科大学南方医院检验医学科），陈静

（南方医科大学南方医院检验医学科），司徒博（南方医科大

 

南方医院检验医学科），刘子杰（云南省检验医学重点实验 室），杨文静（复旦大学附属中山医院检验科），郭巧梅（上海 市胸科医院检验科），朱小立（同济大学第十人民医院检验 科），杜鲁涛（山东大学第二医院检验医学中心），王佳谊（上海 交通大学附属胸科医院检验科，上海市胸部肿瘤研究所） 专家组成员（按姓氏汉语拼音排序）：曹永彤（中日友好医院 检验科），陈鸣（陆军军医大学第一附属医院检验科），陈葳

（西安交通大学第一附属医院检验科），陈维贤（重庆医科大学 附属第二医院检验科），陈鑫苹（海南省人民医院检验科）， 崔巍（中国医学科学院肿瘤医院检验科），丁海涛（内蒙古自治区人民医院检验科），段勇（云南省医学检验临床研究中心， 昆明医科大学第一附属医院检验科），高春芳（上海中医药大学附属岳阳医院检验实验中心），关明（复旦大学附属华山医院检验科），管秀雯（中国医学科学院肿瘤医院内科）， 郭玮（复旦大学附属中山医院检验科），韩艳秋（内蒙古医科大学附属医院检验科），郝晓柯（西京医院全军临床检验医学研究所），侯景辉（中山大学孙逸仙纪念医院病理科）， 胡成进（联勤保障部队第九六〇医院实验诊断科），黄山

（贵州护理职业技术学院科技处），纪玲（北京大学深圳医院 检验科），姜国忠（郑州大学第一附属医院病理科），姜艳芳

（吉林大学第一医院基因诊断中心），柯尊富（中山大学附属 第一医院分子诊断与基因检测中心），李建明（中山大学 孙逸仙纪念医院病理科），李梨平（湖南省儿童医院儿科医学 研究所），李萍（湖南中医药大学第一附属医院医学检验与 病理中心），李忠俊（陆军军医大学第二附属医院检验医学 中心），李卓（西安医学院第一附属医院检验科），林锦骠

（福建医科大学附属第一医院检验科），林勇平（广州医科大学附属第一医院检验科），刘利平（广州医科大学附属第一医院转化医学实验室），刘万里（中山大学附属肿瘤医院检验科），娄加陶（上海市第一人民医院检验科），马飞（中国医学科学院肿瘤医院内科），潘明新（南方医科大学珠江医院肝胆外科），潘世扬（南京医科大学第一附属医院检验医学部），沈佐君（中国科学技术大学附属第一医院科研处）， 史清海（新疆军区总医院检验科），苏建荣（首都医科大学附属北京友谊医院检验科），孙奋勇（同济大学第十人民医院检验科），孙自镛（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科），童永清（武汉大学人民医院检验医学中心），汪俊军

（东部战区总医院检验科），王传新（山东大学第二医院检验 医学中心），王剑（上海交通大学医学院附属上海儿童医学 中心），魏超君（国家卫健委胃肠肿瘤诊治重点实验室，甘肃 省人民医院临床研究与转化医学研究所），吴文苑（深圳市 人民医院检验科），伍均（上海市第一人民医院检验医学中 心），杨定华（南方医科大学南方医院肝胆外科），杨林（深圳 市人民医院胸外科），于农（上海交通大学医学院附属新华 医院苏州分院检验科），张新（新疆生产建设兵团医院检验 科），张义（山东大学齐鲁医院检验科），张樱（解放军总医院 第一医学中心），赵平森（粤北人民医院检验科），赵晓涛（北京 大学人民医院检验科），郑磊（南方医科大学南方医院检验

医学科），郑培烝（福建医科大学附属协和医院检验科）， 周海舟（哈尔滨医科大学附属第一医院检验科），周迎春

（广州中医药大学第一附属医院检验科）

利益冲突    所有作者均声明不存在利益冲突

 

 

参    考    文  献

 

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