学术快讯 08| 《Biosensors and Bioelectronics》发表循环肿瘤细胞灵敏检测新方法

香港城市大学杨梦甦教授课题组于2022年9月9日在《Biosensors and Bioelectronics》期刊发表题为"Dually stimulative single-chain polymeric nano lock with dynamic ligands for sensitive detection of circulating tumor cells"的论文，研究设计了一种具有动态配体的双重刺激响应单链纳米锁探针（SCNL），具有高灵敏度和特异性，实现过表达唾液酸（SA）的广谱肿瘤细胞和循环肿瘤细胞（CTCs）的捕获。除了应用于CTCs的简单计数外，SCNL探针还可以通过检测表面SA的表达水平，评估肿瘤细胞的迁移能力，具有广阔的临床应用前景。

 

论文题图

循环肿瘤细胞（CTCs）是液体活检的重要生物标志物，主要应用于监测癌症进展以及评估治疗效果。因其在人类外周血中的罕见数目（通常在10⁷个白细胞中只有1~10个CTCs），亟需研究人员开发一种高效且精确的检测手段进行表征。目前，CTCs的分析通常包括CTCs富集和检测两步，生化方法中一般使用靶向肿瘤的特异性标志物，如细胞角蛋白（CK），上皮细胞粘附分子（EpCAM），表皮生长因子受体（EGFR），人类表皮生长因子（HER-2）等。然而，由于癌细胞表面缺乏通用抗原，大多数基于免疫亲和力的方法仅限于特定的癌症类型或亚型。此外，由于癌细胞具有异质性，没有上皮标志物表达或表达水平较低的CTCs（特别是与转移相关的间质型CTCs），不能被常用的抗EpCAM抗体检测到。为了应对上述挑战，本研究开发了一种单链纳米锁探针 (SCNL) ，实现了CTCs的高灵敏和特异性临床检测。

 

SCNL检测CTCs的流程和原理

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

研究采用动态结合策略，设计了一种功能化的、具有锁定结构的单链纳米探针（single-chain based nano lock，SCNL），该探针可在酸性微环境条件下及过表达的唾液酸（SA）的双重刺激下动态打开，并与癌细胞结合。

SCNL在癌细胞识别和结合中的应用

研究首先将全血样本和SCNL探针加入96孔板，在孵育的过程中，癌细胞周围的酸性微环境会刺激SCNL探针保护基团（PEG-Glu）与嵌段单链聚合物之间预结合的解体，并暴露苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）官能团，与SA形成共价键和配位键，用于识别广谱癌细胞表面表达的唾液酸（SA）。相比于葡萄糖，解锁后的SCNL（uSCNL）会主要与肿瘤细胞表面过表达的SA分子结合，保证了SCNL探针对癌细胞检测的特异性。此外，保护基团上的PEG有助于减少单核吞噬细胞对SCNL探针的识别和摄取，进一步保证了对癌细胞检测的特异性。因此，柔软的单链锁结构有利于SCNL对肿瘤细胞的逐步协同识别，实现了对癌细胞的高灵敏度、高特异性、高效率和高稳定性的结合。

SCNL解离并识别SA的化学机制及特异性检测癌细胞的机制

 

SCNL探针的合成与表征

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

单链纳米探针（SCNL）的主体为聚N,N-二甲基甲酰胺（PDMA）与丙烯酸酯-苯硼酸（acrylate-PBA）的单链聚合物，将聚合物用Cyanine 3（Cy3）荧光基团进行标记，最后结合聚乙二醇修饰的葡萄糖（PEG-Glu）保护基团。工作探针SCNL通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）进行分析表征，结果表明SCNL探针的平均流体动力学直径为12.8 nm，具有超小尺寸单链特征，同时MTT Assay测定验证了SCNL探针的低细胞毒性，表明SCNL探针具有高生物相容性。

具有锁定结构的单链纳米探针（SCNL）的制备和表征

 

SCNL对癌细胞检测的敏感性、选择性和广谱性

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

为了研究SCNL探针的灵敏度，团队用Cy3标记的SCNL探针来识别SA表达水平不同的Hela细胞、HepG-2细胞和A549细胞，并与正常细胞进行对比。激光共聚焦显微镜（CLSM）显示癌细胞与SCNL探针孵育后细胞膜上荧光强度显著增加。

SCNL检测Hela、HepG-2、A549和hMSC细胞的共聚焦显微图

此外，团队还通过使用流式细胞术和荧光显微镜，对Hela、HepG-2、A549、H1299、H4006、MDA-MB-231和MCF-7细胞系进行测试，进一步验证了SCNL探针针对不同类型癌症的普遍适用性。

流式细胞仪和荧光显微镜分析验证SCNL检测的广谱性

 

血液样本中SNCL检测的实用性

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

癌细胞系证明了基于检测CTCs的可行性，并进一步将该策略用于含有过量白细胞的全血样本中的CTCs检测。研究者通过掺加不同数量的A549细胞到培养基和血液样本中，发现样本的荧光强度与癌细胞数量呈线性关系，这证明了SCNL探针的高回收率、特异性以及实用性。

 

培养基和全血中A549细胞数量与荧光强度具有线性关系

 

SNCL评估癌症转移的能力

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SA的表达水平在肿瘤转移中发挥着重要作用。为了探索了SCNL探针在测定转移性肿瘤细胞SA水平中的适用性，研究者分别构建了高转移和低转移的乳腺癌和肺癌两种模型。结果表明随着高转移细胞比例的增加，荧光信号连续下降。

 

 

SCNL对不同高转移癌细胞比例模型的评估

 

为了进一步区分转移性癌细胞和正常细胞的实用性，研究进一步研究了在脂肪干细胞（ADSCs）存在的情况下，SCNL探针与高转移性MDA-MB-231的结合情况，结果显示MDA-MB-231上有强信号，而ADSCs上几乎没有信号。结果证明了SCNL从正常细胞中区分转移性癌细胞的能力，并有可能通过检测表面SA的表达水平区分转移性肿瘤细胞。

SCNL能够区分ADSCs和转移性MDA-MB-231细胞

 

SNCL与其他CTCs检测方法的比较

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

团队在3例健康人群和5例非小细胞肺癌患者的临床样本中进行了CTCs检测，健康人群血液CTCs基线值可忽略（<3个CTCs/mL），而5例患者血液样本均检测到相当数量的CTCs，证实了SCNL探针的高检出率。基于有限的样本数量，患者CTCs的检测阈值估计为4个CTCs/mL血液。研究者还对SCNL探针检测结果与基于抗EpCAM和抗CD45的免疫荧光染色方法结果进行了对比，获得了相似的结果，证明SCNL探针在CTCs检测中的准确性和适用性。

 

 

SCNL探针对临床样本的CTCs计数及与免疫荧光染色法的对比

 

总结与展望

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

综上所述，这项研究开发了一种适用于广谱癌细胞检测的SCNL探针，通过靶向癌细胞表面过表达的SA，实现对癌细胞的特异性结合和高灵敏检测。首先，动态PEG-Glu保护基团和PBA-SA识别机制保证了SCNL探针对癌细胞的特异性靶向识别。功能化SCNL探针具有超小和单链的特征保证了对于CTCs较高的检测率，其在癌细胞表面的高稳定性、灵活性和标记密度，有助于检测SA表达水平较低的癌细胞，保证了高灵敏度和选择性。同时，SCNL探针还显示出对癌细胞转移风险进行评估的潜能，该探针可以与微流控技术相结合，应用于下游的单CTC的单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV）检测，整合多组学数据，实现高通量和及时检测，满足精准医疗的要求。此外，这项工作也可能启发新一代基于单链的纳米探针的开发，用于癌症转移和其他糖蛋白相关疾病的诊断和治疗等临床应用。

 

 

 

 

文案撰写：晶准生物医学（深圳）临床医学科研部

 

参考文献：

[1] Cui, Miao et al. “Dually stimulative single-chain polymeric nano lock with dynamic ligands for sensitive detection of circulating tumor cells.” Biosensors & bioelectronics vol. 217 (2022): 114692. doi:10.1016/j.bios.2022.114692

 

 

晶准生物医学（深圳）有限公司是集肿瘤精准医疗活检技术研发、产品转化、生产和销售、检测服务为一体的高新技术企业，在肿瘤早筛、动态监测和精准诊断方面都具有多项国际领先的原研核心技术和检测仪器。公司核心技术和科研团队来自于香港城市大学、哈佛医学院、清华大学、爱丁堡大学、哥本哈根大学、贝勒医学院等国际顶尖生物医学机构。公司拥有自研自产高效快速的CTC分选仪、无芯片式数字PCR仪和国内唯一的肿瘤一管同步双检NGS诊断技术，聚焦于肿瘤精准检测。公司旗下晶益检验实验室设有CTC循环肿瘤细胞实验室、PCR肿瘤分子诊断实验室和NGS肿瘤细胞遗传实验室，是国内在肿瘤活检领域检测技术和检测设备最为先进和全面的企业之一。

 

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