202208 八月CTC临床学术解读

本期文章摘要

本期共摘取三篇文章:

第一篇文章于2019年发表在《Science Advances》杂志上(影响因子14.957课题BALB/c小鼠模型中细致的研究了上皮-间质转化(EMT)对乳腺癌(MBC)疾病进展的作用,并发现间质转化受限的E/m型循环肿瘤细胞(CTC)显示出最强的肺转移能力,团队进一步探索了EMT异质性和EpCAM表达是否与MBC患者CTC表型相关,通过随访34MBC患者,团队发现EpCAM+ DTC的比例可用于预测MBC转移和生存率

第二篇文章于2021年发表在《Nature Communications》杂志上(影响因子17.694课题对肝细胞癌(HCC)患者4个血管部位(肝静脉、周围动脉、周围静脉、门静脉)的CTC进行了单细胞转录组测序,揭示了CTC在血传播过程中的转录组的可塑性及其适应机制,团队发现CCL5通过p38-MAX信号调控并募集Tregs以促进CTC的免疫逃逸和转移,在进一步的临床试验上发现Treghigh/CCL5+ CTC能够缩短患者的疾病复发时间并降低总生存期。

第三篇文章于2021年发表在Hepatology杂志上(影响因子17.298)。这篇综述文献首先总结了循环肿瘤细胞(CTC基于免疫亲和力、生物物理学和无富集方法的检测平台,然后基于EpCAM、联合生物标志物、无标记技术、CTC生物学特性和异质性这几个方面分别归纳了相关临床研究文章总结认为未来需要发展高灵敏度和特异性的标准化检测方案,并使用统一的CTC检测平台进行更大样本的多中心、前瞻性研究来推进CTC检测肝细胞癌(HCC临床的应用

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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间质转化受限的上皮型系统性乳腺癌细胞是发生转移的主要来源        1

摘要        1

解读        2

总结        9

通过单细胞RNA测序剖析肝细胞癌的空间异质性和免疫侵袭机制        10

摘要        10

解读        11

总结        19

循环肿瘤细胞的检测及其作为肝细胞癌诊断、预后和治疗监测生物标志物的意义        20

摘要        

解读        21

CTC生物学和临床意义的概述        21

CTC的检测和分离        22

CTC作为生物标志物在HCC者中的研究        25

总结        31

参考文献        31

 

Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with a restricted mesenchymal transition are a major source of metastasis

间质转化受限的上皮型系统性乳腺癌细胞是发生转移的主要来源

 

发表时间:20195

发表期刊:Science Advances

 

文本

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来自上海交通大学的Hongxia Wang团队研究了上皮-间质转化(EMT)对乳腺癌(MBC)疾病进展的作用。团队在BALB/c小鼠模型中揭示了CTC在个体间和个体内具有异质性,其中间质转化受限的上皮型CTCE/m型)具有强大的肺转移能力,这伴随着他们迁移性,非贴壁依赖的细胞生长的侵袭力的增强。团队还通过CTC单细胞测序证明了EpCAM表达与CTC表型具有相关性,EpCAM+ DTC的细胞黏附、增殖和上皮分化能力增强,可作为MBC临床样本的标志物,并进一步发现EpCAM+ DTC的比例可用于预测MBC患者的转移状态临床结局。

 

摘要

癌细胞会发生上皮-间质转化(EMT);然而,EMT的异质性对疾病进展的贡献仍然是一个有争议的话题。在这里,我们阐明了在转移性乳腺癌(MBC)同源小鼠模型中离体培养的循环肿瘤细胞(CTC)和播散性肿瘤细胞(DTCEMT状态。限制性间质转化的上皮型CTC具有最强的肺转移能力,而间质型CTC的转移能力则有限。EpCAM作为替代标志物,用于评价MBC临床样本EMT的异质性,包括转移癌、CTCDTC。上皮型CTC,尤其是DTC的比例与MBC患者的远端转移和较差的预后相关。这项研究加深了对转移过程EMT的理解,并支持了EMT表型异质性作为肿瘤预后和治疗的重要参考。我们进一步表明,依赖于EpCAMCTC分离富集系统将低估CTC的数量,但会定量临床相关的转移癌细胞。

解读

癌症转移始于单个或成群的癌细胞从原发肿瘤组织脱落,随后通过血管内渗入血液。这些循环肿瘤细胞(CTC)最终可能从血管中外渗并扩散到肺部、肝脏或骨髓等远端,在那里被称之为播散性肿瘤细胞(DTC)。在新的环境中,DTC可以保持单个细胞的状态或产生微转移,这可能会导致具有决定性的结果。有假说认为,癌细胞亚群甚至单个细胞上皮-间质转化(EMT过程中的表型变化能够决定性地调节其肿瘤生成能力和转移功能。EMT本身是一种在胚胎发育过程中发挥重要作用的细胞分化程序,它允许上皮细胞分化为间质细胞,并在发育中的胚胎内重新定位。然而,癌细胞能够在不同程度上囊括EMT机制,并使自身具备迁移和侵袭的能力。虽然大量证据认为EMT是全身性癌症和治疗耐药性的原因,但CTCDTCEMT表型对转移形成的实际贡献却未被完整地描述过。

在这项研究中,研究人员在MBC小鼠模型中将CTCDTCEMT表型与肺转移能力相关联,并定义了一种具有混合表型的全身性肿瘤细胞群体作为此模型中最具有侵袭性的细胞类型:它主要上皮,且具有中度向间质转化特征E/m型)。4T1来自于BALB/c小鼠410细胞系,是一种具有6-硫鸟嘌呤6-TG耐药性的MBC小鼠细胞,在植入免疫功能正常的BALB/c小鼠后会形成肿瘤并自发转移,种特征非常接近人类乳腺癌IV的表现在本研究中,团队选用4T1 MBC小鼠模型来分析EMT对体外功能的影响。首先4T1细胞通过皮下移植在BALB/c小鼠的侧腹部位,并在一段时间后处死小鼠并收集原发肿瘤,血液,骨骼和器官,并通过6-TG来恢复4T1细胞(1-1A)。来自血液的4T1细胞系(CTC1)和来自骨髓的4T1细胞系(DTC14T1差异巨大,亲本4T1细胞显示出典型的上皮表型(E型),其细胞之间紧密接触CTC1显示出间质表型(M型),其细胞之间黏附力丧失DTC1则保持了杂交表型,大多数DTC1保留了上皮表型,但仍有少量间质表型亚群(1-1B)。免疫组化染色(IHC)显示4T1DTC1有较高水平的EpCAM、上皮钙粘蛋白(E-cadherin)表达,而CTC1则没有1-1C)。为了证实CTC1确实没有EpCAM的表达,该团队补充了流式细胞仪的分析结果,EpCAM表达量依据其平均荧光强度来计算,并体现在黑色的直方图中,结果证实CTC1细胞中EpCAM的表达完全丧失,除此之外,EpCAMDTC1中的整体表达相比其亲本4T1减少了约50%1-1D)。团队接着评估了4T1CTC1DTC1中部分上皮标志物和间质标志物的mRNA水平,结果显示CTC1中上皮标志物EpCAME-cadherinRab25Grhl2显著降低,而间质标志物N-cadherinVimentinSlugZeb1Zeb2则显著增加(1-1E

在确定了4T1CTC1DTC1表型差异后,团队开始研究EMT表型与肿瘤细胞的行为和功能之间的联系。团队首先经过5细胞培养培养物中代谢水平和细胞数量进行评估,结果显示4T1具有最高的细胞代谢水平,接下来是DTC1,最后是CTC11-1F)。使用3D软琼脂评估4T1CTC1DTC1非贴壁依赖性生长情况,相比较4T1CTC1细胞群具有大幅度增强的非贴壁依赖性细胞生长,而DTC1只有轻微的提升1-1G团队还评估了4T1CTC1DTC1在体内对小鼠内皮细胞、基质胶和明胶的黏附作用,DTC1对内皮细胞的粘附率高于4T1,随后是CTC11-1H)。在伤口愈合实验中进行的细胞迁移实验显示,相比4T1CTC1DTC1的迁移能力分别提升2.3倍和1.9倍(1-1I)。在基质胶包被的Boyden腔室测试中,CTC1有最高的侵袭能力,随后是DTC1,最后是4T11-1J)。这些结果表明,CTC1的增殖和粘附性减少,但迁移性,非贴壁依赖性细胞生长和侵袭能力增强;DTC1则在整体上得到提升,包括保留了一定程度的增殖,略微提升了非贴壁依赖性细胞生长,增强的粘附性、迁移和侵袭能力。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图示

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1-1 4T1 MBC小鼠模型中全身癌细胞的EMT表型和体外功能特性

 

团队在小鼠模型中验证了三种细胞系的致瘤能力,在接入相同数量的4T1CTC1DTC11.25×105)到BALB/c小鼠侧腹皮下组织后3周后发现,DTC1移植小鼠肿瘤的平均重量和大小最高,且成瘤率100%n=8);4T1移植的小鼠虽然均成瘤,但肿瘤重量相比DTC1显著降低;CTC1只有41.2%的成瘤率(7/17),且具有最低的平均肿瘤重量(1-2A)。为了进一步分析CTC1瘤能力,团队在皮下注射了过量的CTC1,发现8倍和16倍剂量CTC1才能达到4T1DTC1诱导形成的肿瘤重量和大小(1-2B)。针对三种细胞系皮下转移能力的结果显示,4T1DTC1具有相同的转移率(80%),而CTC1则在注射了超量的细胞(2×106)后才达到80%的成瘤率(1-2C)。因此,与4T1DTC1相比,单个CTC1具有显著降低的致瘤和转移能力。

接下来通过DTC细胞的皮下移植研究人员从其中四只小鼠的血液中分出26CTC亚系,其中两只小鼠骨髓中建立10DTC亚系。1-2D显示了CTC亚系从上皮到间质的表型转化过程。在EE/mM/eM型细胞亚群中均能够观察到表型异质性,且他们不仅来自不同小鼠的CTC系,还可以来自同一只小鼠(1-2E),这表明在单独的小鼠血液中存在具有不同EMT表型的CTC。对不同表型CTC进行IHC染色发现M/eCTCEpCAME-cadherin表达量较低,而大多数E/mCTC则具有较高的EpCAME-cadherin表达(1-2F)。在E/mCTC中也观察到了更高的代谢和增殖速率(1-2G),对内皮细胞、基质胶和明胶更高的粘附性(1-2H)以及入侵能力方面显著但非常轻微的增加(1-2I)。

为了研究三种细胞系在血液中发生肺转移的能力,团队E型细胞(4T1),E/m型细胞(CTC6-6CTC6-11CTC8-1),M/e型细胞(CTC8-6CTC8-5CTC8-1)和M型细胞(CTC1)以同样的数量(5×104)接入BALB/c小鼠的静脉(1-3A)。并在19天后对表面转移进行计数和体外转移群落形成测试,结果表明,与MM/e型细胞相比,EE/m型细胞具有增强的转移能力,混合表型E/m型)CTC细胞系表现出最高的转移能力(1-3B)。为了验证转移指数的差异是由于M/eCTC发生肺转移的潜伏时间长,而不是固有的转移能力降低,团队小鼠临近生命终点时处死并检查肺转移的情况,结果显示,在九只CTC8-1n=4CTC8-5n=5小鼠中,两只显示出严重的肺转移(22.2%四只在较大的骨骼附近转移(44.4%三只有多个肿瘤位点(33.3%1-3CCTC8-6n=5)注射的小鼠没有严重的肺转移,五只小鼠全部发生大骨骼附近转移,其中三只产生多个肿瘤位点(1-3D1-3E描述了浅表肺转移灶的数量、转移群落和每个注射细胞的相应转移指数,并证实了E/mCTC6-6转移指数较高。

团队通过分析EpCAM表达与EMT表型的相关性,判断EpCAM能否作为MBC临床样本的替代标志物。通过流式细胞术在4T1衍生的细胞系中定量EpCAM的表达,结果显示从骨髓中培养的DTC和从器官转移物中培养的亚系均表达更高的EpCAM,并且从DTC1小鼠血液分离的CTC亚系,具有显著异质的EpCAM表达1-4A。在Spearman相关性分析中,EpCAM表达较高的EMT评分呈负相关r = 0.728, P < 0.0011-4B。因此EpCAM的表达在原发性和全身性的4T1细胞系中的表达具有异质性CTCEpCAM高表达与上皮表型的保留有关,在单动物体内,血液CTCEMT也具有高度异质性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

日历

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1-2 4T1CTC1DTC1的体内致瘤性和源自DTC1CTC细胞系的EMT特征

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

日程表

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1-3 4T1CTC1DTC1移植动物的转移发生情况

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图示

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1-4 EpCAM表达与上皮型细胞和人类CTC具有相关性

 

研究人员进一步探究了EMT异质性以及EpCAM表达与CTC上皮型的相关性能否在MBC患者中得到观察,他们从MBC患者身上收集了原发性肿瘤和相应的淋巴结转移(n=12),肝转移(n=10),肺转移(n=8骨转移n=8组织,并对EpCAM进行IHC染色,结果显示,EpCAM在转移瘤中的表达更高(1-4C),这也进一步验证了4T1 MBC小鼠模型的结果。团队还对CTC进行单细胞DNA测序,检测EpCAM+n=10)和EpCAM-n=20CTC中全基因组拷贝数变异(CNV),并在能够区分出EpCAM+CNV使用GO富集分析受影响基因的潜在功能,发现与紧密连接(CLDN3STRNPTPN13有丝分裂细胞周期(CCNB1SHBEIF4EBP1DUSP3ABL1乳腺上皮细胞分化(ERBB4)和乳腺导管形态发生(GLI2CSF1R)相关基因得到了扩增,表明EpCAM+ CTC的细胞黏附,增殖和上皮分化的能力增加(1-4D)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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1-5 EpCAM+全身肿瘤细胞的比例与MBC患者的临床结局相关

研究人员最后评估了EpCAM的表达是否与MBC患者转移状态和疾病结果相关。1-5A描述了单个/集群CTCDTC代表性的SE-iFISH结果。在34个病人中共分离出845CTC71910DTC1-5Btop展示了每个患者CTCDTC数量的关联,与血液相比,骨髓中的细胞集群数量更高(1-5B middle),EpCAM+ DTC的比例65.9%EpCAM+ CTC的比例22.4%更高(1-5B bottom34例患者中,20例(58.8%)血液中没有可检测的EpCAM+ CTC12例(35.3%)骨髓中没有可检测的EpCAM+ DTC1-5C)。临床结果表明CTCDTC的高比例与可检测的器官转移呈正相关性,且高比例的EpCAM+ DTC与肺转移的发生显著相关1-5D)。对所有患者中位随访11个月,并应用受试者工作特征曲线(ROC)来确定EpCAM+ DTC比例在6个月生存期中的敏感性和特异性,结果显示EpCAM+ DTC的比例能够准确预测MBC患者6个月死亡风险(AUC0.785CI0.588-0.983P = 0.0181-5E其中EpCAM+ DTC比例大于20%的患者显示出总体生存期的严重下降(1-5F),在排除了EpCAM二倍体CTCDTC后,EpCAM+ CTCDTC的比例分别下降到6.3%56.9%EpcAM+非整倍体CTCDTC的比例与远端和肺转移相关1-5H),此外,EpCAM+非整倍体DTC的比例准确预测了MBC患者6个月的死亡风险AUC0.793CI0.599-0.988P = 0.015)(1-5IEpCAM+非整倍体DTC比例大于15%的患者显示出总生存期的严重下降1-5J

 

总结

img25这项研究利用MBC小鼠模型理解EMT在癌症转移中的作用,以准确概括MBC的临床情况。团队MBC小鼠模型III期和IVMBC患者的临床队列中证实,具有混合E/m表型的CTC极大地促进了结果限制性转移的形成,且EpCAM+DTC可以准确预测6个月的生存期和总生存期另外,由于在EMT转化过程中CTC容易丢失EpCAM,因而依赖EpCAMCTC富集方法(如CellSearch)将低估CTC的数量。对CTCDTC数量进行定量并根据其EMT表型细分全身性肿瘤细胞,对改善转移风险的预测,并支持治疗决策是有益的。

Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma

通过单细胞RNA测序剖析肝细胞癌的空间异质性和免疫侵袭机制

 

发表时间:20217

发表期刊:Nature Communications

 

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复旦大学附属中山医院樊嘉院士团队通过对肝癌HCC患者血管4个不同部位(肝静脉、周围动脉、周围静脉、门静脉)CTC进行单细胞转录组测序,描述血液传播过程中CTC转录组的动态变化,并进一步研究了CTC可塑性的分子机制。团队还通过体内外测试验证了CTC能够通过CCL5募集Tregs分子,并在血液运输的过程中建立有利于转移的微环境。

摘要

人们对于循环肿瘤细胞(CTC)在播过程中转录组可塑性和适应性机制知之甚少。在此,我们使用单细胞全长RNA测序的方法检测了肝细胞癌患者(HCC4个不同的血管部位的113个单CTC转录组包括肝静脉(HV)、周围动脉(PA)、周围静脉(PV)和门静脉(PoV)。我们揭示了CTC的转录动力学液传播过程中的应激反应、细胞周期和免疫逃避信号有关。此外,我们发现趋化因子CCL5CTC免疫逃避的一个重要介质。从机制上来描述CCL5CTC中的过表达受到p38-MAX信号的转录调控,它募集调节性T细胞(Tregs以促进CTC的免疫逃逸和转移播种。总之,我们的研究结果揭示了以前被忽视的CTC空间异质性免疫逃逸机制,这些结果可能有助于针对HCC患者设计新的抗转移治疗策略。

解读

        多项研究认为循环肿瘤细胞(CTC)是肝癌肝内和肝外转移(EHM)的“种子”。在播散过程中,CTC暴露在包含许多类型的压力血液微环境如失巢凋亡,剪切力,氧气/营养剥夺和免疫监视,只有克服这些困难癌细胞才能成功定植。因此,靶向CTC并研究其血液传播过程中的变化可能会揭示新的肿瘤转移机制。虽然CTC单细胞RNA测序(scRNA-seq)取得了较大的进展,但关于CTC传播过程中可塑性和适应机制的数据却很缺乏。包括本文作者团队在内的研究人员已经证明CTC在血液运输过程中会动态激活上皮-间质转化(EMT),因此团队进一步假设CTC在传播的过程中可能会在时间和空间上调节其表型和分子信号,以便在不适宜的微环境中存活并在远端定植。

为了研究这个问题,团队在六名HCC患者中分离CTC通过EpCAM+/Pan-CK+CD45-鉴定(2-1ab随后进行scRNA-seq单细胞低通全基因组测序LP-WGS所有经过测序的7个细胞都显示出拷贝数变异(CNV),而两个CD45+细胞(WBC)则没有2-1c,这表明使用该方法分离出的细胞可被认定为CTC紧接着,团队找到10例根治性切除手术前的HCC患者,在肝静脉(HV)、周围动脉(PA)、周围静脉(PV)和门静脉(PoV四个不同的血管部位分离出295CTC,并选用其中119个来做进一步的测序分析,最终保留113CTC通过scRNA-seqt-分布邻域嵌入算法(t-SNE)来得到二维可视化数据图(2-1d,结果显示CTC原发肿瘤和细胞系被区分成三种不同的转录模式通过基因集富集分析GSEA)确定了CTC中上调的分子通路,包括细胞迁移和侵袭,细胞周期,抗凋亡,免疫反应和促进凝血的信号通路(2-1e)。

接着,团队探索了CTC集群在迁移过程中的空间转录异质性。团队首先发现,从患者不同血管分离出来的CTC强烈地类聚于患者个体而非血管类型,这表明患者间的异质性要高于血管间的异质性(2-2a)。接下来,团队分析了一位患者(P9)中四个血管位点CTC在细胞间转录的多样性,在HV中发现了具有显著异质CTC集群,而PA中的CTC则表现出显著降低的异质性(P < 0.001PVPoV则再次显示出CTC异质性的增加(P < 0.001P9患者中观察到的CTC空间异质模式在另外5位患者身上进一步得到了证实2-2b2-2c描述了CTC通过PAHVPV传播肝细胞癌的血流路径接下来,团队对每个血管位点特异性表达的基因进行富集,发现HVCTC表达了氧化磷酸化/外源性代谢相关基因,PACTC表达了与GPRC信号传导相关的基因,PVCTC表达了免疫应答/细胞因子产生相关基因,而PoVCTC则表达了细胞周期相关基因2-2d这些结果表明,来自不同血管的CTC在其转录谱中显示出明显的血管内/间异质性,暗示着在血液运输过程中,诸如血液动力学压力,细胞因子和免疫细胞的相互作用以及氧气/营养物质的剥夺等生物和物理诱因,会不断地调节CTC表型的多样性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 1

2-1 基于RNA-seq表征CTC、原发灶和HCC细胞系之间的基因表达差异

 

团队进一步研究了CTC可塑性的分子机制,在差异表达分析中,团队发现了2428个在临近血管之间表达水平有显著变化的基因,总体而言,PACTC的转录活性降低,而PVPoVCTC转录活性则增加(2-3a)。最显著的变化发生在HVCTCPACTC之间,下调的基因明显富集于有关细胞生长和增殖的通路,静脉血管参与MYCG2/M检查点通路的基因在一些CTC中再次上调(图2-3b,静脉血管中的CTC会过度表达缺氧相关基因,并将自身重编程为缺氧表型以应对缺乏氧气的环境2-3c细胞周期阶段的特异性特征在CTC的一个亚群中高度表达,将循环细胞与非循环细胞区分开来2-3dHVPACTC中上调的基因强烈地富集于补体蛋白,EMT,血小板激活和趋化因子信号传导。值得注意的是,与EMT相关的基因(SPARCIGFBP2),肿瘤细胞-血小板微聚集物形成相关基因(GP1BAVWF)和免疫抑制趋化因子相关基因(CCL5CXCL5)从HVPA的表达增加,并且在PVPoV中保留了他们的高表达水平2-3e)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 2

2-2 CTC的空间转录异质性

 

接下来,团队对促进CTC产生免疫逃避的关键基因进行了差异表达分析,其中免疫抑制趋化因子CCL57高表达基因中排在首位(2-4a)。团队进一步通过IHC染色来检查CCL5在肿瘤微血管CTC中上调表达结果与原发性肿瘤相比,CCL5CTC中几乎完全表达(中位数:63% vs 2%, P = 0.021)(2-4b)。团队进一步在一个独立的HCC队列(n=27)中进行验证,发现13名(48%)检测到 CCL5+ CTC,在41CTC中有27个(66%)是CCL5+ CTCCCL5HVPV中显著上调,并在PVPoV中保持较高水平(2-3e)。有关文献显示,CCL5参与募集免疫抑制性Tregs到肿瘤微环境,以促进免疫逃逸,团队证实了CCL5+ CTC在空间上与FOXP3+ Tregs非常接近,且与CCR5+ Tregs有正相关性,但与周围血管中的CD3+ CD45RO+/-FOXP3- T细胞无关,这证实了两种细胞之间的相互作用(2-4c)。CCL5+ CTC的数量与一个独立的HCC队列中CCR5+ Tregs的数量和总循环Tregs数量呈正相关(r = 0.870.86P < 0.0001n=27)(2-4d)。Kaplan-Meier生存分析进一步揭示了CCL5+ CTC和循环Tregs平衡的临床意义,相比Treglow /CCL5+ CTClowTreglow /CCL5+ CTChighTreghigh /CCL5+ CTClowTreghigh /CCL5+ CTChigh具有统计学上显著缩短的疾病复发时间TTR和较差的总生存期(OS)(2-4e)。综上所述,这些数据为团队的假设提供了强有力的临床证据,即CTC可能通过CCL5的表达来募集Tregs以促进免疫逃逸。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 3

2-3 CTC转录组的动态变化突了循环过程中应激反应和细胞周期异质性的通路改变

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 4

2-4 CCL5+ CTCTregs正相关关系,预测HCC患者术后复发情况

 

团队还在4个具有不同转移潜力的HCC细胞系中表达CCL5,来验证CCL5能否促进新分离的循环Tregs的体外迁移能力,相比HepG2Huh7MHCCL这些低转移潜能的细胞系,具有高转移潜能的MHCC97H细胞系显示出较高的CCL5表达(2-5a相比Huh7细胞系MHCC97H能够显著提高募集Tregs的能力,抗人类CCL5中和抗体则能够显著抑制Treg的迁移活性(图2-5b。为了在体内验证CCL5募集TregCTC存活和转移形成方面的作用,团队在敲除/未敲除CCL5的免疫活性C57BL/6J小鼠中,通过尾静脉注射了5×106Hepa1-6小鼠肝癌细胞(2-5cd)。相比空载体对照组,CCL5敲除小鼠能够在12个小时内更快地清除Hepa1-6细胞,注射到Treg耗尽小鼠体内的空载体对照细胞的清除速度也明显快于对照组2-5e)。团队进一步评估了通过尾静脉注射表达CCL5HCC细胞对循环Tregs数量的影响,结果显示注射后6hCCL5敲低组比对照组的循环Tregs数量显著减少(2-5f)。CCL5耗尽的Hepa1-6细胞表现出显著受损的肺部和肝转移能力(2-5g),并且CCL5下调消除了Treg募集并促进活化的细胞毒性T淋巴细胞CTLs)的浸润(2-5h)。添加CCL5抗体可以有效地阻断对照组CTC在体外募集Tregs的能力(2-5i)。这些体外和体内测定结果表明,CTC利用自防御机制通过CCL5来募集Tregs血液运输过程中建立有利于转移的微环境。

 

为了确定CCL5候选调节因子,团队首先在单细胞数据集中筛选了表达与CCL5正相关的转录因子(TF),与原发肿瘤相比,CTC中上调的43TF33个与CCL5表达呈正相关,MYC相关因子XMAX)具有最高的排名(r = 0.86, P = 2.04×10−35)(2-6a)。进一步的KEGG分析表明CTC中上调的基因在p38 MAPK通路富集,表明p38-MAX信号活化在调控CTCCCL5转录方面发挥作用。通过染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因分析,结果显示在MHCC97H细胞系中MAX能够直接结合CCL5基因的启动子(2-6b)。通过siRNA敲低的MAX和通过抑制剂阻断p38 MAPK通路,均可显著抑制CCL5表达(图2-6cd),与对照组相比,MAXCCL5耗尽能够抑制Hepa1-6细胞增殖和迁移的潜力(2-6e),通过IHC染色,我们进一步发现MAXCCL5敲除都与Tregs显著减少和活化的CTLs浸润相关(2-6f。为了进一步研究Tregs如何帮助诱导CCL5HCC细胞中的表达,团队在有/Tregs共培养的Huh7细胞的培养基中使用流式微球技术CBA检查了五种成熟的Tregs衍生细胞因子,包括TGF-β1IL-10IL-35VEGFTNF,结果显示TGF-β1是其中含量最高的细胞因子(2-6g)。此外,MAX的耗尽或抑制p38信号传导显著阻断了TGF-β1诱导的CCL5MHCC97H细胞中的表达(2-6h)。这些证据综合表明外周Tregs通过p38-MAX信号传导分泌TGF-β1诱导CCL5表达。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 5

2-5 CTC通过CCL5表达募集Tregs,以产生一个免疫抑制和促进肿瘤发生的微环境

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 6

2-6 p38-MAX途径CCL5诱导表达

总结

        CTC异质性在不同的血管室之间存在显著差异,从肿瘤部位转移至血管中的CTC可能代表肿瘤内的异质性。研究者基于单细胞转录组测序来研究HCC患者4个血管部位CTC转录组的动态变化,揭示了CTC在血液转运中的可塑性,利用多种免疫逃避策略,包括EMT、血小板-CTC聚集体和免疫抑制趋化因子的产生团队进一步发现了通过p38-MAX调控CCL5表达募集Tregs,内在和外在信号协同作用,促进CTC的免疫逃逸和转移该团队的发现提出了靶向Tregs的免疫治疗可作为一种有前景的抗肿瘤策略,靶向CCL5或者CCR5/4可以提供消灭血管内CTC的机会,阻止它们到达远端器官,降低HCC发生转移的风险。

这项研究的局限性是每个血管部位进行测序的CTC数量相对较少,并且分离出的CTC中,超过一半没有通过scRNA-seq的质量控制CTC的单细胞RNA测序实验包含了复杂多步骤的流程:CTC富集、表征、单细胞操作测序准备以及许多其他可能损害单个CTC RNA质量的因素。因而,获取大量适合进行下游生物信息学分析的单CTC转录组数据极其困难未来优化CTC单细胞RNA测序相关的实验流程。

 

Detection of Circulating Tumor Cells and Their Implications as a Biomarker for Diagnosis, Prognostication, and Therapeutic Monitoring in Hepatocellular Carcinoma

循环肿瘤细胞检测及其作为肝细胞癌诊断、预后和治疗监测生物标志物的意义

 

发表时间:20211

发表期刊:Hepatology

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

img33

西达赛奈医学中心的Ju Dong Yang团队总结了循环肿瘤细胞(CTC)作为生物标志物,在肝细胞癌(HCC)的诊断、预测和疗效监测方面的作用。团队回顾了目前基于CTC的免疫亲和力、生物物理学性质和无富集方法的检测平台,并归纳了CTC在肝细胞临床治疗中的相关研究。

 

摘要

肝细胞癌HCC是全球癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一。HCC的不良预后主要归因于晚期肿瘤,这个阶段尚无有效的治疗方法能让患者长期生存。目前可用的检测方法如甲胎蛋白AFP作为HCC诊断或预后生物标志物的准确性有限。肝活检提供的组织可以揭示肿瘤生物学特征,但具有侵袭性和肿瘤播种的风险宜用于常规检测,尤其是在早期患者中。除此之外,由于肿瘤内异质性,肝活检在全面揭示肿瘤生物学特征方面也受到限制。对新的生物标志物的需求是显而易见的,尤其是在改善HCC检测、预后、预测治疗反应和疾病监测方面,而液体活检可能是早期发现和治疗HCC的有效方法循环肿瘤细胞CTC是来源于原始肿瘤或转移灶的循环中的癌细胞,通过液体活检对其进行检测,能够促进精准医疗在HCC患者中的实施,具有巨大的潜力。CTC可以通过简单的外周血抽血检测,并显示肿瘤的整体特征。基于免疫亲和力和生物物理特性开发了各种CTC检测平台,以高效鉴定和捕获CTCCTC的定量丰度,以及CTC的生物学特征和基因组异质性,可以预测HCC患者的疾病预后和治疗反应。这篇综述文章将讨论目前可用的CTC检测和分离技术、它们在HCC患者临床管理中的实用性、它们的局限性和未来的研究方向。

解读

肝细胞癌(HCC在全球癌症并发中位居第六,在癌症死亡中位居第四。HCC生物标志物在早期检测和预后以及预测和监测治疗反应方面存在未满足的需求。目前,甲胎蛋白 AFPHCC应用最广泛的生物标志物。每年两次的肝脏超声检查联合/不联合血清AFP美国肝病研究学会(AASLD)、亚太临床实践指南(APASL)、欧洲肝脏研究协会(EASL推荐的HCC主要筛查策略。然而,AFP敏感性差,作为HCC早期检测的生物标志物的作用受到限制基于蛋白的血清肿瘤标志物如AFP凝集素组分AFP-L3和脱羧基凝血酶原DCPAFP联合使用时可改善诊断。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3GPC3细胞角蛋白19CK19高尔基体蛋白73GP73中期因子Midkine骨桥蛋白Osteopontin鳞状细胞癌抗原SCCA和膜联蛋白A2Annexin A2均已被证明在HCC患者中具有诊断和预后作用,但尚未被广泛应用于临床实践。肝活检可对肿瘤组织进行直接采样,并进行肿瘤的分子表征。然而,它是一种侵入性检测,有出血和肿瘤播种的风险此外HCC具有显著的肿瘤间和肿瘤内异质性,含有少量肿瘤组织的单个活检标本可能无法代表整个HCC肿瘤组织近年来,多种HCC生物标志物进行检测的“液体活检”技术显示出可期的前景,其中循环肿瘤细胞(CTC)具有独特性,因其代表了对患者活肿瘤细胞的。对CTC进行分析,例如识别靶基因的特定突变,有助于预测治疗反应耐药性,指导治疗计划。这篇综述文章将讨论CTC相关的生物学当前和新兴技术,以及HCC诊断和预后方面的各种研究。

 

一、CTC生物学和临床意义概述

恶性肿瘤在增殖并侵入临近组织的过程中,通过分泌基质金属蛋白酶来断裂基底膜,并使得肿瘤进入附近血液和淋巴管(3-1)。一旦进入血流,肿瘤细胞就会变成CTC,并在循环的过程中到达身体的不同组织并侵入它们。虽然大多数CTC被失巢凋亡、免疫攻击或剪切应力杀死,但CTC在上皮-间质转化(EMT)的过程中却获得了生存能力,并进一步提高了其转移能力。CTC还会与纤维原细胞、白细胞、内皮细胞或血小板形成CTC相比单个CTCCTC具有更高的存活能力和转移潜能。有研究表明,原发灶和转移灶的肿瘤细胞具有显著的异质性,因此,CTC液体活检不应当被视为组织活检的一种侵入性较小的替代方法,而是对肿瘤异质性进行全面了解的方法。

CTC液体活检具有很高的前景,但在广泛应用之前,仍有技术障碍需要攻克。CTC血液循环中的数量极少往往与肿瘤体积成正比,这使得早期疾病的CTC检测具有很高的挑战性。因此,将CTC检测的灵敏度和特异性提高到准确全面分子表征所必需的水平,是接下来CTC检测技术发展的挑战之一。ctDNA液体活检的另一个主要方面,主要来源于濒死的肿瘤细胞或者吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞,ctDNA可用于鉴定异质性肿瘤特异性突变和表观遗传学改变,监测接受治疗患者的肿瘤状态但是,目前还不清楚ctDNA能否准确代表增殖活跃发生转移的肿瘤细胞的基因组成ctDNA相比,CTC液体活检的主要优势是能够捕获完整的、有活力的肿瘤细胞。只要保留细胞完整性,捕获的CTC可用于功能分析试验,并进行培养以评价耐药性。

 

图示

描述已自动生成3-1 HCC CTC的生成、富集和生物学特征

 

二、CTC检测和分离

目前已经开发了几种系统来改善CTC的检测和分离。检测平台主要可分为三类:基于免疫亲和、基于生物物理性质和无富集方法(3-13-23-3)。

 

免疫亲和

基于免疫亲和力的CTC富集技术使用针对细胞表面标志物的抗体,它们通常被修饰在检测设备表面或者磁性物质上。阳性富集通常指使用针对CTC表面表达的特异性肿瘤相关抗原的抗体进行捕获,阴性富集则指使用抗CD45的抗体来减少造血细胞。直到近年来,CTC被定义为有核上皮细胞粘附分子EpCAM+/CK+/CD45-细胞。CellSearch系统唯一获得美国食品药品监督管理局FDA批准的CTC诊断技术,使用EpCAM抗体包被的磁实现分离CTC-chip微流控设备由抗体包被的微柱组成几何方式排列以优化细胞附着效果CTC-iChip结合了微流控和免疫磁性技术,其高于CellSearch平台的灵敏度已得到证明Wang开创了“NanoVelcro”的独特概念,使用抗体包被的纳米基底微流控集成混合器促进CTC基底接触,以增强CTC捕获能力

 

3-1 基于免疫亲和力的CTC检测平台

基于免疫亲和力的CTC检测平台

检测平台

平台原理

关键特征

捕获率

参考文献

CellSearch

免疫磁性法

EpCAM功能化磁珠FDA唯一批准的用于转移性前列腺、乳腺和结直肠癌的CTC计数平台

≥85%

1

MACS

免疫磁性法

磁性纳米粒子MNPs与各种抗体偶联;相对表面积可用于阳性/阴性富集

40%-90%

2

SERS

免疫磁性法

磁性纳米粒子MNPs作为CTC富集平台和表面增强拉曼散射(SERS信号扩增基底使用抗ASGPR纳米颗粒和抗GPC3纳米棒进行HCC CTC进行双重选择分离

>90%

3

SE-iFISH

免疫磁性法;原位核型分析

结合差相富集,后进行原位表型和核型表征特别适用于鉴定非整倍体染色体

70%-87%

4

CTC-chip

微流控

几何排列的微柱 (µpCTC-Chip) 产生层流优化细胞附着骨状槽 (HBCTC-chip) 和微增加细胞接触到抗体涂层的表面高纯度全血处理

>60%

5

CTC-iChip

微流控;免疫磁性法;惯性聚焦

按顺序排列:微柱阵列、惯性聚焦和磁泳(使用确定性侧向位移分离包括CTCWBC在内的有核细胞,在微流控通道中排列有核细胞,并收集磁性标记细胞)结合微流体和磁性的细胞分选

97%

6

NanoVelcro

微流控

EpCAM/ASGPR/GPC-3包被的纳米基底微流控集成混合器促进CTC与基底接触,增强HCC-CTC捕获。波形蛋白(+) CTC被确定为HCC的不良预后亚组

80%-94%

7

生物物理学性质

使用“无标记”方法(膜过滤、密度梯度分层、惯性聚焦等技术)来区分CTC和血细胞,能够CTC的下游处理更加容易,因为分离出的CTC没有抗体标记。微孔过滤的主要优势在于快速处理血液进行CTC富集,但是微孔过滤可能受到堵塞的影响,白细胞和CTC尺寸上的交叠增加了高纯度富集的挑战性。密度梯度离心主要基于白细胞和CTC之间比重的差异,Ficoll-Paque已经能够在各种癌症患者中检测CTCOncoQuick结合离心和过滤技术Ficoll-PaqueCTC捕获率更高,RosetteSep整合免疫亲和力与密度离心技术,并使用靶向广泛抗原混合物的抗体复合物。离心的方式由于可靠和廉价被广泛应用于CTC分离,但最好作为其他富集策略之前的初始步骤使用。惯性聚焦利用不同大小细胞惯性效应间的差别来筛分CTC适用于筛分尺寸大于血液细胞的CTC该方法已被整合到许多微流控装置中,这些设备检测CTC的灵敏度高,并且CTC能够保持一定活性。双向电泳技术(DEP利用CTC和血细胞介电性质的差异来分离CTCDEPArray可以在DEP笼中捕获单CTC并用于高特异性的遗传分析。

 

3-2 基于生物物理特性的CTC检测平台

基于生物物理特性的CTC检测平台

检测平台

平台原理

关键特征

捕获率

参考文献

ISET

微孔过滤

基于细胞尺寸分离通常大于血液细胞的CTC聚碳酸酯轨道蚀刻薄膜中有纳米至微米级别的孔隙

N/A

8

ScreenCell

微孔过滤

基于细胞尺寸分离通常大于血液细胞的CTC聚碳酸酯轨道蚀刻薄膜中有纳米至微米级别的孔隙

74%-91%

9

CellSieve

微孔过滤

精确排列的孔隙,能够在低压状态下捕获CTC,并保存胞内结构

83%-91%

10

FMSA

微孔过滤

柔性聚合物微弹簧可最大限度地减少细胞损伤可直接从全血中快速富集

90%

11

CanPatrol

微孔过滤;免疫磁性法

微滤后使用RNA原位杂交检测EMT标志物

80%-89%

12

Ficoll-Paque

密度梯度离心法

价格低廉,与其他技术结合使用CTCPBMC的比值保持不变

84%

13

OncoQuick

密度梯度离心法;微孔过滤

分离介质上方存在多孔滤膜通过过滤进行额外分离CTC捕获率优于Ficoll-Paque

87%

14

RosetteSep CTC Enrichment Cocktail

密度梯度离心法;免疫磁性法

向广泛CTC抗原混合物的抗体复合物配合Ficoll-Paque等离心平台提高捕获效率

36%-60%

15

DEPArray

电泳

通过电极阵列在DEP笼中捕获单细胞可以回收单个 CTC

N/A

16

 

无富集方法

所有富集技术都需要对捕获的细胞进行验证,高速、荧光成像的发展促进了在没有富集步骤的情况下直接识别血液样本中的CTC,这节约了大量的时间成像流式细胞利用较高的核质比大小等参数区分CTC和白细胞。光声流式细胞术PAFS基于激光技术实时检测静脉中的CTC直接成像。检测CTC的功能试验,利用肝细胞活性的各个方面,如肿瘤相关蛋白的分泌和CTC优先粘附到特殊的基质上。

 

3-3 基于无富集技术的CTC检测平台

基于无富集技术的CTC检测平台

检测平台

平台原理

关键特征

捕获率

参考文献

ImageStream

成像流式细胞

利用大小、核质比的差别检测CTC无需抗体或复杂的血样处理

N/A

17

PAFC

体内直接成像

吸收激光的纳米颗粒通过抗体标记在靶向细胞上使用基于激光的技术实现静脉中CTC实时检测

N/A

18

EPISPOT

功能测定

通过鉴定单个上皮癌细胞分泌/释放/脱落(基于抗体)的蛋白在单细胞水平上检测CTC。理论上可任何CTC富集步骤相结合。

N/A

19

 

三、CTC作为生物标志物在HCC患者中的研究

基于EpCAMCTC检测相关临床研究

常用的、基于免疫亲和力的CTC富集技术如CellSearch已被用于检测和捕获HCC患者的EpCAM+ CTC3-4)。2013年,Sun等使用CellSearch检测接受肿瘤切除的HCC患者的EpCAM+ CTC术前67%HCC患者检测EpCAM+ CTC术前CTC计数2被证明是术后肿瘤复发的预测因素。使用CellSearch的其他研究表明,HCC患者中EpCAM+ CTC的存在与血管浸润AFP显著升高更晚期的巴塞罗那分期BCLC)、疾病进展更高的复发率和更短的总生存期相关2014年,Guo等建立了基于阴性富集和逆转录PCRRT-PCR检测EpCAM+ CTC的优化平台,与CellSearch系统的一致性达到76.7%2016年,Wang等人使用CTC-BioTChip60%HCC患者n = 42中检测EpCAM+ CTC,发现CTC的阳性率和数量与肿瘤、淋巴结和转移分期均有显著相关性。2016年,Zhou等人研究了EpCAM+ CTC和调节性T细胞TregHCC患者的预后价值,发现EpCAM+ CTCTreg水平升高与早期复发和临床预后不良有关。不幸的是,基于EpCAMCTC富集平台受到发生EMTCTC中上皮标记物缺失的限制。此外,研究表明,只有部分30%-40%HCC细胞表达EpCAM

 

3-4 基于EpCAMCTC检测研究

基于EpCAMCTC检测研究

研究

患者

平台和方法

标志物

主要发现

Sun et al.,(20) 2013

肝细胞癌 (n=123);良性肝病 (n=5); 健康志愿者 (n=10)

CellSearch

EpCAM

67%术前患者发现CTC28%在切除后1个月发现CTC≥2CTC/7.5 mL预示复发

Schulze et al.,(21) 2013

肝细胞癌 (n=59); 良性肝病 (n=19)

CellSearch

EpCAM

31%HCC患者中发现CTC与晚期、血管浸润和较短的总生存期相关

Guo et al.,(22) 2014

肝细胞癌 (n=299); 肝良性肿瘤 (n=24);慢性肝病 (n=25); 健康志愿者 (n=71)

RosetteSep, MACS, RT-qPCR

EpCAM

ROC曲线下面积(0.70);敏感性42.6%);特异性96.7%。结合AFP水平,ROC曲线下面积改善至0.86,灵敏度73.0%,特异性93.4%

Kelley et al.,(23) 2015

肝细胞癌 (n=20); 良性肝病 (n=10)

CellSearch

EpCAM

40%转移性HCC患者发现CTC≥1/7.5 mL与血管浸润和总生存期降低相关

Wang et al.,(24) 2016

肝细胞癌 (n=42)

CTC-BioTChip

EpCAM

60%HCC患者中发现CTCCTC阳性率和数量与TNM分期高度相关

Zhou et al.,(25) 2016

根治性切除的肝细胞癌患者 (n=49); 健康志愿者 (n=50) 

RosetteSep, Quantitative RT-PCR

EpCAM, CD4+CD25+Foxp3+

EpCAM mRNA+ CTCCD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量高的患者术后复发 (67% vs.10%) 1年复发 (50% vs.10%) 的风险更高

von Felden et al.,(26) 2017

手术切除的肝细胞癌患者 (n=57)

CellSearch

EpCAM

15%HCC患者发现CTCCTC阳性与高复发和短中位无复发生存期相关

Shen et al.,(27) 2018

经动脉化疗栓塞的肝细胞癌患者 (n=89)

CellSearch

EpCAM

56%HCC患者发现CTCCTC数量增加与死亡和进展相关

Yu et al.,(28) 2018

肝细胞癌 (n=139); 肝良性肿瘤 (n=23)

CellSearch

EpCAM

CTC≥2的患者的无疾病生存期和总生存期短于CTC<2的患者

基于联合标物的CTC检测相关临床研究

为了克服基于EpCAMCTC检测平台在HCC中的低灵敏度,一些研究关注了替代标志物(3-5)。例如,去唾液酸糖蛋白受体ASGPR是一种仅在肝细胞表面表达的跨膜蛋白,已被用于多种HCC患者进行CTC检测富集方法中2011年,Xu等利用生物素化的无唾液酸胎球蛋白ASGPR的配体结合HCC细胞进行免疫磁性分离,能够在81%HCC患者中检测到CTCCTC的存在和CTC的数量均与肿瘤范围、合并门静脉癌和分化状态显著相关。2014年,合成的抗ASGPR抗体代替ASGPR配体,89%HCC患者中检出CTC。通过使用抗ASGPRCPS1的抗体混合物,结合阴性富集,在HCC患者中实现了91%CTC检出率。2016年,Zhang使用具有ASGPRP-CKCPS1抗体的CTC芯片,从100%HCC患者n=36中分离出CTCCourt使用NanoVelcro CTC AssayEpCAMASGPRGPC3的多标记组在97%HCC患者中检出CTC

 

3-5 基于联合标志物的CTC检测研究

基于联合标物的CTC检测研究

研究

患者

平台和方法

标志物

主要发现

Xu et al.,(29) 2011

肝细胞癌 (n=85); 良性肝病 (n=37); 其他恶性肿瘤 (n=14); 健康志愿者 (n=20)

AutoMACS

ASGPR, HER2, TP53

81%HCC患者发现CTCCTC的阳性和数量与肿瘤范围合并门静脉癌、分化状态和疾病范围相关

Li et al.,(30) 2014

 

 

 

 

肝细胞癌 (n=27); 其他恶性肿瘤 (n=12); 肝硬化 (n=13); BLT (n=11); 慢性肝炎 (n=7); 健康志愿者 (n=15)

AutoMACS

 

 

 

 

ASGPR, CPS1, P-CK

 

 

89%HCC患者中发现CTC;特异性ASGPR和高效富集HCC-CTC联合抗P-CK和抗CPS196.7%)优于单独使用一种抗体CPS162.1%P-CK85.2%

 

Mu et al.,(31) 2014

肝细胞癌 (n=62); 慢性肝炎 (n=7); 健康志愿者 (n=15)

MidiMACS

ASGPR, GPC3, CK

HCC患者GPC3ASGPRCK表达增加;阳性/阴性预测值分别为GPC390%71%)、ASGPR93%75%)、CK83%29%);GPC3ASGPR表达与总生存期降低相关

Liu et al.,(32) 2015

肝细胞癌 (n=32); 其他恶性肿瘤 (n=17); BLT (n=12); 肝硬化 (n=15); 慢性肝炎 (n=10); 急性肝炎 (n=3); 健康志愿者 (n=20)

Ficoll-PaqueRosetteSep

ASGPR, CPS1

白细胞的CD45消耗相比ASGPR+选择能够回收更多的CTC与任抗体单独使用相比,抗ASGPR和抗CPS1联合使用改善了CTC检测,能够91%HCC患者中检测到CTC

Zhang et al.,(33) 2016

肝细胞癌 (n=36); 良性肝病 (n=14)

CTC-chip

ASGPR, P-CK, CPS1

100%HCC患者中检测到CTC捕获的CTC很容易从CTC芯片中释放出来,随后可以在三维细胞培养试验中扩增成球结构

Pang et al.,(3) 2018

肝细胞癌 (n=8); 健康志愿者 (n=5)

表面增强拉曼光谱(SERS

ASGPR, GPC3

SERS纳米平台在100%HCC患者中检测到CTC能够用少量血液进行检测

 

基于无标记(生物物理和无富集)方法检测CTC的相关临床研究

3-6列举了使用无标记方法检测HCC患者的CTC2000年,Vona使用二维微孔过滤系统ISET检测接受肝切除的HCC患者的CTC,并且能够在术中捕获肿瘤微栓子。CellSearch平台检测患者CTC的能力相比, ISET的性能显著优越于CellSearch系统ISET100%CellSearch28%然而,ISET却难以释放CTC进行下游遗传分析。2016年,Liu等人使用成像流式细胞术IFCHCC患者的血液样本中检测CTC,使用CTC观察到的较高核HKR与传统的基于CD45-EpCAM+ CTC检测方法相比,使用HKR细胞的IFC显示出显著更大的受试者工作特征曲线下面积AUC0.82 vs. 0.73Ogle等人研究了以细胞大小为重点的IFC,并将其有效性与由CKEpCAMAFPGPC-3DNA-K组成的多标记组进行了比较。IFC纳入大小标准,结合CD45细胞的耗竭,导致捕获所有阳性生物标志物CTC,以及另外28%不表达任何检测的生物标志物的CTCIFC的优点是易于操作,成本效益高,不需要抗体或复杂的血样处理。然而,其特异性可能受到免疫细胞存在的限制,免疫细胞也具有较大的体积和HKR

 

3-6 基于标记技术的CTC检测研究

基于无标记技术的CTC检测研究

研究

患者

平台和方法

标志物

主要发现

Vona et al.,(8) 2000

手术切除的肝细胞癌患者 (n=7); 慢性肝炎 (n=8); 健康志愿者 (n=8)

ISETRT-PCR

AFP, PSA

HCC患者术前/术后CTC检出率分别为43%86%ISET允许在手术过程中对细胞形态、CTC计数进行后续分析,并证肿瘤微栓子的存在

Vona et al.,(34) 2004

肝细胞癌 (n=44); 慢性肝炎 (n=30); 肝硬化 (n=39); 健康志愿者 (n=38)

ISET

N/A

52%HCC患者中发现CTC门静脉瘤血栓形成和生存期缩短相关

Morris et al.,(35) 2014

肝细胞癌 (n=52)

ISETCellSearch

EpCAM, GPC-3

ISET100%HCC患者中检测到CTCCellSearch28%ISET检测GPC-3阳性CTC与原始肿瘤中的GPC-3阳性细胞一致率为100%

Liu et al.,(17) 2016

肝细胞癌 (n=52); 健康志愿者 (n=12)

IFC

HKR

使用HKRIFCAUROC0.82HCC患者微血管血栓形成的发生率显著较高,复发风险和死亡率也较高

Ogle et al.,(36) 2016

肝细胞癌 (n=69); 肝硬化 (n=16); 健康志愿者 (n=15)

IFC

Cell size, CK, EpCAM, AFP, GPC-3, DNA-K

CTC增加与肿瘤分期较晚、门静脉血栓形成和生存期较差相关

CTC的生物学特性和异质性

多标物组合面板和下游分子分析可以揭示