202207 七月CTC临床学术解读

 

        

 

 

肿瘤液体活检临床学术文献汇编

2022年第期)

 

 

 

 

 

晶准生物医学(深圳)有限公

本期文章摘要

本期共摘取三篇文章:

第一篇文章于2018年发表在《Cancer Discovery杂志上(影响因子39.4该项研究揭示了CTC转录物前列腺癌症药物治疗反应和早期扩散的相关性。该研究纳入了两个研究队列分别为接受阿比特龙一线治疗的转移性前列腺癌患者和接受了前列腺癌摘除术的局部前列腺癌患者。该研究通过分析患者血液中的CTC转录物表达情况并且分析了对应的总生存期(OS)、影像学无进展生存期(R-PFS以及病理临床风险分组。该研究结果提示CTC检测有助于判断患者的治疗反应筛选术后淋巴结转移风险较高的患者

第二篇文章于2022年发表在《Annals of Surgical Oncology》杂志上(影响因子5.344该研究揭示了CTC全转录组测序可以作为组织活检的替代以无创的方式监测乳腺癌患者的转移。该研究分析了被纳入的患者的CTC、转移灶组织和外周血的全转录组表达情况并对其进行了分组。转移灶组织样本和外周血相比CTC表现出更高的免疫肿瘤靶点表达CTC和组织样本上的预测性生物标志物表达情况高度一致。此外单核苷酸变异(SNV)分析显示基因突变的复杂性会随着时间的推移增加。该研究结果表明了在患者治疗前后通过CTC监测基因表达变化情况以评估乳腺癌演变的重要性。

三篇文章于2017年发表在《Nature Communications》杂志上(影响因子17.694该项研究基于多参数流式细胞术来富集循环肿瘤细胞(CTCs并通过全基因组mRNA测序寻找脑转移乳腺癌患者(BCBM)的CTC原发性乳腺癌患者(pBC)之间的差异进而提出循环肿瘤细胞基因特征这一概念。团队研究并发现了一系列BCBM CTC生物标志物并发现了新的造血和免疫逃逸信号通路可能在CTC驱动的免疫逃逸和有丝分裂在激活中发挥重要作用。这项研究支持了CTC检测作为早期检测微转移性脑疾病的筛查方法以及应用CTC的分子特征来制定疗法和监测治疗反应的临床可能性。 

 

  

可基于循环肿瘤细胞的RNA特征预测前列腺癌的治疗反应和早期扩散        1

摘要        

解读        

总结        8

术前循环肿瘤细胞检测与胰腺癌切除后早期远端转移和生存率下降相关        9

摘要        9

解读        10

总结        16

脑转移相关乳腺癌的CTC分子特征的研究        17

摘要        17

解读        18

总结        22

 

 

An RNA-based digital circulating tumor cell signature is predictive of drug response and early dissemination in prostate cancer

可基于循环肿瘤细胞RNA特征预测前列腺癌的治疗反应和早期扩散

 

发表时间:20183

发表期刊:Cancer Discovery

 

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来自哈佛医学院的Miyamoto DT带领的研究团队验证了循环肿瘤细胞(CTCRNA转录物前列腺癌药物治疗反应和远端转移的相关性。该团队开展了项临床试验分别纳入了27转移性前列腺癌患者以及34例局部前列腺癌患者。该研究通过分析患者血液中的CTC转录物表达情况并且分析了对应的总生存期(OS)、影像学无进展生存期(R-PFS以及病理临床风险分组。该研究结果提示CTC检测可能有助于判断患者的治疗反应提示术后发生肿瘤早期传播风险较高的患者。

 

摘要

血液里的肿瘤标志物在转移性前列腺癌中占据着重要的临床意义在转移性前列腺癌mCRPC患者特征性骨转移病灶取样较为困难因此需要找到可替代组织活检的生物标志物。该研究使用微流控技术富集CTCs随后CTC前列腺衍生的转录物进行数字定量。根据CTC中显著升高且与前列腺癌相关的基因分别针对mCRPC和局部前列腺癌患者的基因加权评分以评估患者的预后、治疗反应以及复发风险该研究开展的一项前瞻性试验中纳入了27例接受一线阿比特龙治疗的去势抵抗性前列腺癌患者通过评估治疗前CTCM值以辨别高风险人群该人群总生存率低(P=0.01影像学无进展生存期短(P=0.046)。6名生存期≤12个月的患者CTCs均检测到了HOXB13表达CTCs亚组中检测到ARV7剪接变体。在第二组研究队列中纳入了34患有局部前列腺癌的男性术前CTCL评分升高可预测镜下精囊和/或淋巴结扩散转移P < 0.001)。因此CTC特异性转录物进行数字定量能够实现无创监测有望指导转移性和局部性前列腺癌的治疗。

 

解读

寻找适用的血液肿瘤标志物转移性和局部疾病的前列腺癌个体化治疗重要的一环晚期前列腺癌的典型特征是发生骨转移此时患者不能轻易进行肿瘤活检取样因此迫切需要无创的肿瘤特异性反应预测指标雄性激素剥夺疗法(ADT通过抑制了该肿瘤组织中增殖的主要驱动因素以达到治疗前列腺癌的效果大多数mCRPC患者在治疗初期时会疗法(ADT)有反应然而反应持续时间有限后续则会出现耐药性因此mCRPC患者需要可以新的疗法代替ADT例如雄激素合成的强效抑制剂、雄性激素受体(AR)抑制剂、疫苗疗法、细胞毒性化疗、放射性治疗以及PARP抑制剂目前已有研究者提议CTC定量作为指导治疗方案的潜在替代终点然而CTC在前列腺癌患者血液样本中的稀缺性和缺乏特定的与治疗反应相关的分子限制了其临床应用。

虽然CTC检测可以连续、无创地监测前列腺癌肿瘤进展但其在临床中的应用一直技术障碍所限制从血液样本中分离稀有细胞的复杂平台基于细胞成像和评分均是CTC临床应用上的技术难题近年来微流控技术的发展使得CTC捕获和富集得到了飞跃性的进步研究者之前单细胞RNA测序结果证明了通过微流控技术分离的前列腺CTC中含有高度完整的RNA很容易与白细胞区分开来从而实现基于RNA的诊断。同时通过数字PCR检测CTCRNA序列能够快速且准确地检测肝细胞癌中的CTC实现肝癌早筛基于此该研究建立了一个基于CTCRNA分子特征在微流控富集CTC后对其进行高通量和高度定量的检测方式为数字CTC检测。在一项使用阿比特龙治疗mCRPC的前瞻性试验中确定了与临床结果相关的预测性CTC衍生分子标志物。此外在接受根治性前列腺切除术的局限性前列腺癌症患者中CTC的数字检测对手术时发现的病理性精囊浸润和淋巴结扩散具有预测作用。

研究者们首先确定了一组在正常造血细胞中几乎表达的前列腺特异性转录物接着选择了多种标记物解决前列腺癌细胞的异质性以及检测包括细胞信号通路活动从公开的前列腺CTC的单细胞RNA测序结果数据库中得出了40个初步的候选基因11个转录物在前列腺肿瘤中具有较高的表达水平但在正常血细胞中没有可检测的RNA读数。其中8个基因在与正常血细胞混合的前列腺癌细胞中信号最强针对性的优化了引物与反应条件为了确认所选8基因的表达差异性研究者使mCRPC患者血液样本中分离出来的CTC进行单细胞RNA测序并与白细胞的单细胞RNA测序结果进行比较。12例转移性前列腺癌患者的76CTC与单个白细胞相比转录物富集程度大幅上升(图1-18个基因包括雄激素反应性转录物KLK3KLK2TMPRSS2AGR2;雄激素抑制转录物FOLH1HOXB13;以及雄激素不依赖性转录物FAT1STEAP2

 

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图1-1 mCRPC患者中分离出来的白细胞单个前列腺CTC中8个基因的表达情况

 

随后研究者进行了转移性前列腺癌患者的CTC评分测试数次CTC检测的可行性。该队列纳入了12mCRPC患者、8例局部前列腺癌患者、34名男性健康献血者和5名女性对照1-2A8个基因的CTC检测信号研究队列中的对比结果。12mCRPC患者和19名男性对照的样本中计算8个基因的信噪比并通过每个基因与mCRPC患者和对照组之间的中位数差异进行加权得出CTCM(图1-2B该数值被用于检测患者的转移情况11/1292%)名转移性前列腺癌患者的CTCM呈阳性健康男性献血者中均为阴性P=0.00812例局部前列腺癌患者中也均为阴性值得注意的是一些局部病变的前列腺癌患者的样本有几个基因也出现了低水平信号(图1-2A在所有的mCRPC患者中CTCM与血清PSA蛋白测量值没有显著相关性(R2=0.03P=0.58)(图1-2D这一发现与之前的研究结果一致血清PSA水平与CTCKLK3mRNA相关性较佳(R2=0.36P=0.04(图1-2E数字CTCM的评分提供了有关疾病状态的信息这些信息不重叠且可能与血清PSA测量值正交

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图1-2 不同的基线CTC数量以及肿瘤分期对应的RFS 

 

前列腺癌中经常会出现两种特定的RNA融合基因为了给CTC中前列腺癌相关转录物定量该研究使用数字PCRTMPRSS2-ERG融合转录物和AR-V7剪接变体mRNA进行检测。TMPRSS2-ERG融合转录物在于超过一半的前列腺癌病例中出现AR-V7剪接变体则是AR靶向疗法耐药的标志物。将单个前列腺癌细胞添加到对照全血标本进行纯化检测时两个基因都具有高度的特异性和敏感性(图1-3A检测mCRPC血液样本时15mCRPC患者中有5名(33%)有TMPRSS2-ERG融合8名(53%)有AR-V7剪接变体4名(27%)在其CTC中同时检测出两种转录物12例健康男性捐赠者的血液样本中两种转录物均为阴性(图1-3BAR-V7的表达情况在原发性前列腺癌1/15)和zhuu转移性前列腺癌患者中分离出来的CTC8/15)不一致(图1-3C该结果AR-V7是晚期难治性mCRPC治疗过程中出现的标志物相符合。该项队列的研究结果表明可以通过对mCRPCR患者CTC异常的前列腺转录物的RNA进行数字定量根据CTCM筛查对AR靶向治疗反应不佳的患者。

 

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图1-3 TMPRSS2-ERG和AR-V7在前列腺癌细胞系、不同患者的CTC和组织中的表达情况

 

随后为了测试CTC衍生的特征是否可以作为ADT后对AR靶向治疗反应的预测标志物研究者前瞻性的评估了27名一线使用阿比特龙治疗的mCRPC患者。该研究比较数字CTC检测与传统的基于免疫荧光的CTC检测(图1-4ABCTC数量较多的样本中显微镜检测和数字CTCCTCM之间的一致性显著在识别CTC方面数字CTC检测基于多光谱的荧光成像显微镜检测要更加灵敏在存活的患者中中位随访时间为13个月CTCM升高可显著预测较差的总生存期(图1-4CP=0.01)和阿比特龙一线治疗中的患者出现影像学疾病进展显著相关(图1-4DP=0.046)。值得注意的是HOXB13CTC中的表达与更差的总生存期以及疾病进展显著相关(图1-4EP=0.004)。mCRPC患者中检测到AR-V7剪接变体的表达已被证明可以预测对患者对阿比特龙和恩扎鲁胺产生耐药性通过数字CTC检测对治疗前血液样本中的AR-V7进行定量检测发现每毫升血液中的转录物为0220个。在治疗前4/22患者的AR-V7表达可被检测到表达水平显著高于平均信号2个标准差检测CTC中的AR-V7高水平表达可以预测总生存期1-4F)和影像学无进展生存期较短为了分析联合治疗前CTCHOXB13AR-V7是否能识别阿比特龙治疗后出现早期死亡<12月)的高风险患者研究者在22例患者中检查了这两种标志物1-4G6名接受一线阿比特龙治疗后早期死亡的患者中所有人HOXB13为阳性只有2人的AR-V7水平升高6/1346%HOXB13阳性的男性患者早期死亡CTC中没有HOXB13表达的患者则为0/14P = 0.006)。因此AR-V7转录物>14.7/mL血液预测一线阿比特龙进展的患者具有高特异性HOXB13的表达则可以识别更多的治疗无反应患者。

 

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图1-4 CTCM、CTC上HOXB13和AR-V7表达情况的临床意义

 

由于局部前列腺癌患者血液中CTC较少研究人员针对该情况开发了一个高度量化的评分系统用于早期疾病中的CTC检测可能用于辅助区分侵袭性和非侵袭性的局部前列腺癌。由于CTCM局部前列腺癌男性中产生的信号水平相对较低研究者需要通过全转录组扩增(WTACTC转录信号进行扩增(图1-5A再用液滴数字PCR进行检测。该检测方式被应用于34例将要接受前列腺切除术的局部前列腺癌患者中。根据单个基因对精囊浸润或淋巴结受累的预测价值研究者开发了CTCL值以评估局部前列腺癌早期传播风险(图1-5B患者术前CTCL值较高与前列腺根治术时发现的精囊侵犯或淋巴结受累密切相关(图1-5CP<0.001)。通过比较CTCL交叉验证结果和标准临床病理风险分组CTCL在该队列中对病理结果的预测价值更准确(图1-5D1-5E1-5F)。对于CTCL评分高的患者SVILN侵袭的阳性预测值(PPV)为100%常用的D’Amico临床风险组高分患者的PPV33%以及UCSF CAPRA评分中为60%而这三组测量阴性预测值(NPV)相似。所以结果表明数字CTC分析有助于预测局限性前列腺癌而接受手术切除的患者是否存在早期传播

 

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图1-5 CTCL值交叉验证结果标准临床病理风险分组对比

 

总结

该研究通过数字PCR对血液标本中富集的CTC的转录物进行数字定量开发出一种高灵敏度和特异性CTC评估数值可以预测转移性前列腺癌患者对的阿比特龙的治疗反应和局部癌症的早期扩散。为寻找可指导前列腺癌治疗的生物标志物提供了新的思路CTC检测有望被用于前列腺癌的治疗和转移性疾病的分子靶向药物的使用中

 

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Circulating Tumor Cell Transcriptomics as Biopsy Surrogates in Metastatic Breast Cancer

循环肿瘤细胞转录组分析可用于替代转移性乳腺癌的组织活检

 

发表时间:20221

发表期刊:Annals of Surgical Oncology

 

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南加州大Lang JE团队发表了转移性乳腺癌MBC治疗前后循环肿瘤细胞(CTC肿瘤组织的全转录组测序结果对比验证了CTC预测乳腺癌者治疗后出现转移风险的临床意义。该研究数据显示CTC肿瘤组织上的生物标志物表达具有一致性提示CTC检测可以作为组织活检的代替品。同时肿瘤细胞内的基因表达在治疗前后会出现变化表明在不同节点检测CTC的基因表达情况有助于观察肿瘤演变。

 

摘要

研究背景:转移性乳腺癌(MBC以及导致肿瘤转移的循环肿瘤细胞(CTC)与原发性乳腺癌有本质上的不同。该研究评估了CTC的全转录组RNA测序结果是否可以作为转移性乳腺癌的活检替代物。

研究方法:该研究纳入了19例新诊断的MBC患者并且对其转移灶组织活检、CTC和外周血(PB)进行了RNA测序。

研究结果:研究者根据主成分分析结果CTC、转移灶组织组织和外周血的基因表达归为不同的组。与转移灶组织PB相比CTC中肿瘤免疫靶点的表达更高。CTC和转移灶组织中的预测性生物标志物(n=64)表达情况高度一致。治疗后再次收集患者样本并进行RNA测序后发现肿瘤细胞内信号通路的激活发生了变化。单核苷酸变异(SNV)分析显示随着时间的推移突变的复杂性越来越大。

研究结论:CTC单细胞测序结果可以作为乳腺癌转移的生物标志物并为疾病生物学和临床治疗带来新的见解。

解读

        转移性乳腺癌(MBC)是几乎所有乳腺癌患者死亡的原因。由于MBC的生物标志物特征往往与原发肿瘤不同美国临床肿瘤学会指南要求对乳腺癌患者的转移灶进行组织活检通过其生物标志物的检测结果指导治疗决策并非所有转移部位都适合接受活检穿刺。靶向治疗问世MBC患者生存率得到了提高然而大多数患者最后还是会产生耐药性分析肿瘤的分子特征可以指导靶向治疗原发肿瘤组织或单一转移灶活检的基因检测结果可能无法反映多处转移灶的基因特点。

循环肿瘤细胞(CTC)检测作为微创的液体活检手段在实时评估病人的肿瘤生物学和异质性方面具有巨大的潜力。CTC预后作用已被多项研究证明52-71%MBC患者血液中可以检测到CTC尚未为靶向治疗提供预测性见解CTC检测还未被广泛用于指导治疗决策。主要问题在于一些技术上的限制阻碍了CTC的生物学研究以及临床实践之中的应用目前临床上大多数测序方法都集中在DNA测序上但并非所有DNA变异都会表达。随着RNA测序RNA-Seq技术的崛起目前除了能对CTC进行基因检测有望通过液体活检预测治疗效果该研究探讨了CTC辨别潜在治疗目标的可能性。对CTC进行全转录组RNA-Seq后分析分子特征观察到MBC肿瘤异质性。同时CTC转录组测序结果用于辨别乳腺癌转移生物标记物有助于新靶点耐药机制的研究

该研究纳入了21未经治疗的MBC患者19例患者的CTC RNA样本符合质控标,,每位患者在基线(治疗前)或在疾病进展后需要转换治疗方案前都被收集了活检样本以及血液样本其中4例患者在治疗后约6个月重新接受抽血监测CTC变化情况研究者首先对血液、肿瘤组织以及外周血样本进行了基因表达分析。主成分分析PCA显示PC1中大多数CTC、转移灶组织外周血分离PC2CTC和转移灶组织外周血分离(图2-1A)。2-1BCTC、转移灶组织外周血基因表达的组间比较维恩图。通过选出每两组样本中5上调或下调幅度最大的基因并进行比较后发现RNA-Seq可以在CTC中检测到与转移灶组织外周血不同的基因表达特征。

 

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图2-1 患者的CTC检测结果与对应的首次复发器官分布图

 

接着以外周血作为对照研究者们进一步分析了CTC转移灶组织与免疫反应相关的基因表达量(图2-2CTC转移灶组织以及外周血进行对比后CTC转移灶组织中共有12个基因出现过表达15个基因出现下调的情况。差异基因热图所示CTC中具有更多肿瘤免疫应答相关基因的差异表达(过度表达:CTC vs.转移灶组织131vs. 15;下调: CTC vs. 转移灶组织38 vs. 37)。共有12个过表达和15个下调的基因在CTC和转移灶组织之间表达情况一致。值得注意的是与外周血相比PD-L1CTC和转移组织中的表达量都显著降CTC vs. 外周血 p = 3.5 × 10−5CTC vs 转移灶组织p = 0.004;转移灶组织 vs. 外周血p = 0.004

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图2-2 在CTC、转移灶组织和PB中与免疫反应相关的基因的表达量(RPKM)

 

此外研究者发现78%潜在临床靶点基因在CTC和对应的转移灶组织中表达情况相似没有基因在所有样本组(CTC以及转移灶组织)中出现一致地表达或下调(图2-3A仅有4.7%的基因在CTC与转移灶组织中的表达有统计学意义上的差异AKT3 p = 0.018 CCND1 p = 0.025FOXA1 p = 0.034。图2-3B为该研究中3个具有代表性的患者样本与外周血对照相比大多数CTC和转移灶组织样本均具有出这些潜在靶向基因的过度表达少数基因例外(即较低表达或弱表达< 2倍)。该研究结果表明CTC有望为发生远端转移的乳腺癌患者辨别潜在用药靶点。

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图2-3 CTC和转移灶中的潜在靶点基因表达情况

 

4例患者在另一时间点再次接受了CTC样本采集同时也提供了的相关的影像学研究和治疗方案信息(第一个和第二个CTC采集节点之间的平均时间为4±0.8个月)。展示了两例代表性转移灶为胸腔积液的患者结果2-4AB患者1ER/PR阳性HER2阴性。该患者在接受他莫西芬(Tamoxifen)后CTC激素受体基因在不同节点中均显示下调CTC受体(p = 0.014)和细胞周期基因(p = 0.0005在不同节点的表达情况也均具有统计学差异。2-4CD为患者15ER阳性PR/HER2阴性该患者第二个节点的CTC样本显示在使用多柔比星(Doxorubicin)治疗后DNA损伤修复基因出现上调(图2-4D)。两位患者的CTC样本在第二个节点均被观察到了细胞周期基因表达下调。这些数据揭示了在治疗压力下每个患者的生物特征演变对临床管理具有意义。

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图2-4 患者1、15不同节点CTC和转移灶组织内的标志物基因表达情况

 

在所有纳入的样本中研究者共在1754个基因上检测到了单核苷酸变异SNVs转移灶组织中有31%SNVs也存在于CTC(图2-5A所有样本中共检测到2258个体细胞突变 CTC中检测到SNVs数量比转移灶组织高出9.4CTC2041转移灶组织217p = 0.01(图2-5BCOSMIC数据库中的数据进行比对后研究人员在CTC样本中检测到的SNV344个(17%和在转移灶组织中检测到的SNVs42个(1.9%(图2-5CD样本中突变频率最高的20个基因依次AHNAKALMS1ANKRD12ARID1AARHGAP35BEST1BPTFCALM2F5HIVEP1MACF1MDN1MIK67MUC3AMUC12MUC16SOS1TET2WIPF1ZFHX4研究者使用cBioPortal在公开的数据库转移性(n = 396)与非转移性(n = 5158)乳腺癌样品进行比较后验证了这些基因(图2-5E以上20个基因中有17个在乳腺癌样本中产生突变变异等位基因频率0.29%不等(图2-5F)。转移性和非转移性病例之间的SNVs存在显著差异(P = 0.009单个基因的差异高达10倍。将该项研究的RNA-Seq数据库与IntOGen-mutations平台确认的184个乳腺癌驱动基因进行对比该研究数据库中涵盖了44/18424%)的SNVs34/4477.3%)的SNVs只存在于CTC4/449.1%)的SNVs只存在于转移灶组织5/4411.4%)的SNVs同时存在于CTC和转移灶组织分析结果表明CTC中可检测到的SNVs比转移灶组织更多与潜在靶点相比CTC和转移灶组织SNVs的分析结果一致性较低该分析方式还需要在未来进一步验证。目前暂时没有通过RNA-Seq分析SNVs的统一标准研究者们需要开发更好的工具从复杂的样本(如CTC)中分析SNVs

 

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图2-5 CTC与转移灶组织中检测到的单核苷酸变异(SNV)

总结

        该研究结果表明与转移灶组织活检相比CTC中的体细胞突变数量更多CTC中的SNVs数量随时间推移而增加CTCRNA-Seq结果可用于检测MBC患者的驱动基因突变。CTC单细胞测序通过微创、实时的检测方式辅助诊断策略的定制帮助患者得到精准治疗。液体活检有望代替组织活检用于检测潜在的临床靶向基因表达和突变纵向评估患者癌症的演变。

Molecular characterization of breast cancer CTCs associated with brain metastasis

脑转移相关的乳腺癌CTC的分子特征的研究

 

发表时间:20178

发表期刊:Nature Communications

 

文本

描述已自动生成

 

休斯敦卫理公会医院的Dario Marchetti团队基于多参数流式细胞术来捕获、分离和表征脑转移乳腺癌患者的循环肿瘤细胞(CTCs寻找可用于乳腺癌脑转移BCBM筛查和早期诊断的新的生物标志物。该团队对CTC进行全基因组mRNA测序得到4528个基因在CTC和原发性乳腺癌(pBC)中的表达存在差异针对BCBM CTCs各亚群的全基因组测序显示出126有别于pBC独特基因特征。该团队提出使用新鉴定的Ki67+/uPAR/int-β1Notch1+CTCs作为检测BCBM患者治疗后反应的指标并呼吁使用CTC作为微转移性脑疾病的早期检测方法。

 

摘要

EpCAM阳性的循环肿瘤细胞(CTCs)计数可用于评估乳腺癌患者的总体转移负担。深入理解乳腺癌脑转移(BCBM)相关的CTCs是很有必要的因为这有助于BCBM的早期识别和疗效评估。我们在此报告BCBM CTCs明显富集于一些细胞亚群它们可以被其生物标志物的表达和突变的内容所识别。通过全面分析CTC的转录组我们发现了一种独特的有别于原发性乳腺癌组织的循环肿瘤细胞基因特征CTC gene signature。通过对其基因特征的进一步分析我们确定了与BCBM CTCs相关并可能增强BCBM的信号通路。本研究提出与BCBM CTCs相关的生物标志物和信号通路它们既可作为脑部微转移的检测方法又可用于做出合理的治疗决策和评估患者的治疗反应。

 

解读

播散性癌细胞通常需要数年甚至数十年才能发展在放射学上可检测的转移性肿块而当它们被检测到时转移性肿块通常会以指数级的速度增殖因而排除了使用治愈性治疗方案的可能脑转移乳腺癌BCBM患者尤其如此30%BCBM患者无法被目前的放射学方法诊断只有在尸检时才能被诊断出来Dario Marchetti团队的研究人员综合以往的研究做出假设:处于转移谱两端癌细胞的增殖率的差异应该在体现在从这些部位脱落的CTCs的行为上因此BCBM CTCs进行鉴定有助于脑转移的筛查和早期诊断并帮助确定疗法及其特异性靶向治疗BCBM的有效性。

本研究基于FACSArial系统CTCs的分子特征进行鉴定具体通过以下三个步骤1.鉴别并消除死细胞。2.使用谱系特异性抗体去除在外周血中的细胞。3.筛选出PanCK+上皮的)CD44+/CD42-干细胞样)阳性CTCs研究者在一个有10名乳腺癌患者和3名健康捐赠者的队列中验证了这一方法的可行性。3-1a展示了此方法捕获、分离和鉴定了上皮性和干细胞样乳腺癌CTC的具体工作流程该方法能直接从乳腺癌患者血液中分离出来CTCs并且相比CellSearch®具有更强大的捕获能力(图3-1b:使用FACSArial系统能够在每8mL血液中得到101839CTCs而相同的受试在使用CellSearch®并行处理时只能在每7.5mL血液中得到088CTCs

常用的EpCAMCKCD45的抗体染色不可避免地会排除掉干细胞样的和去分化的EpCAM阴性细胞因此本研究中研究人员使用抗CD45CD44CD24PanCK的抗体进行免疫细胞化学染色用于鉴定上皮CTCPanCK+)或干细胞样CTCCD44+/CD24-染色结果显示分离的CTC表达了所选择的生物标志物(3-1c它们的表达在DEPArray中得到进一步证实了(图3-1d。为了进一步验证分离出的CTC的特征独立于其细胞表面标志物的表达研究人员进行了这些CTC全基因组和mRNA组分析Sanger测序结果显示分离的CTCTP53基因上具有多个热点突变而从相同患者中分离出的正常CD45+/CD34+细胞则没有(3-1f实时荧光定量PCR检测得到PanCK+ CTC的上皮标志物如KRT8KRT9EpCAM的表达量可能高出2100肿瘤标志物如ESR1MYCN的表达量则高出324 CD44+/CD24-CTCs这些基因的表达较低3-1e

 

 

图片包含 图形用户界面

描述已自动生成图3-1 通过多参数流式细胞仪分离乳腺癌CTC流程

 

接下来研究人员对10名晚期乳腺癌患者的CTC进行的全基因组mRNA微阵列分析并与31个原发性乳腺癌(pBC)患者基因表达数据集进行对比。结果显示在CTCs中有29758个基因下调而只有1972个基因上调表明CTC转录活性普遍较低(3-2a)。CTCs作为一个单独的组聚集在一起而并没有与其相应的pBC分子亚型对应(3-2d这表明CTCs之间比其对应pBC的更相似。本项研究中CTC上调的1972个基因在三种pBC亚型中也都均匀上调更进一步地支持了这个观点。与乳腺癌细胞系对比发现分离的CTC与基底型细胞系联系最为紧密(3-2c)。通过进一步下游通路富集分析预测核受体和多能性相关通路激活增加同时蛋白质的翻译机制和促进生长信号传导减少在细胞功能中表现为CTC上调基因参与了细胞死亡、凋亡和存活、同时细胞增殖和侵袭特性降低(3-2b)。根据转录组结果研究者们假设大部分CTC亚群会以代谢和有丝分裂活动减少的状态存在更好在循环中存活。

 

 

 

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3-2 晚期乳腺癌患者CTCpBC样本转录组对比

 

生物标志物Ki67常用于评估原发性乳腺癌组织的增殖指数是乳腺癌脑转移的重要预后因素而生物标志物尿激酶型纤溶酶原激活物受体uPAR)和整合素β-1int-β1)在体外和体内都直接和乳腺癌休眠和再激活相关Ki67uPAR/int-β1的表达在CTCs具有显著一致性同时我们也检测到了Ki67uPAR/int-β表达不一致的单个CTC3-3a因此在单细胞水平中需要进一步评估Ki67uPAR/int-β1CTC生长停滞中的互补作用。研究人员因此设计了一种单步流式细胞术的方法以取代免疫荧光染色和DEPArray对患者血液中的CTC进行分析16名乳腺癌患者8名有BCBM8名无BCBMBCBM患者的Ki67高表达的CTCsKi67High CTCs)是Ki67低表达的CTCsKi67Low CTCs)的两倍而无BCBM患者的Ki67Low CTCs则比Ki67High CTCs多约60%3-3c)。研究人员还比较了有/BCBM患者样本中的uPAR-/int-β1-uPAR+/int-β1+的比率结果表明它们在没有BCBM的患者中表达无差异但是在BCBM患者中uPAR+/int-β1+的表达增加了2.4倍(3-3d)。流式细胞分析也显示大多数的Ki67High CTCs具有较高的uPAR/int-β1表达(3-3e大多数uPAR+/int-β1+ CTC具有更高的Ki67表达(3-3f因此这些生物标志物在每一个不同定义的CTC子集方面是互补的。研究人员从BCBM患者中分离出uPAR-/int-β1-uPAR+/int-β1+ CTC亚群以及未患有BCBM的患者对(ER+/PR+/HER2-通过对这些亚群的全基因组测序得出BCBM患者基因突变率显著高于未患有BCBM的组别并且在uPAR-/int-β1-uPAR+/int-β1+亚群中也是如此(3-3b)。总而言之这些生物标志物的表达差异以及CTC突变表明至少有一部分BCBM CTC的行为与其他组别是不同的。

图形用户界面, 图表

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3-3 乳腺癌患者CTCs中与细胞增殖相关的生物标志物表达情况

 

接下来研究人员试图寻找与乳腺癌脑转移相关的CTC信号通路10名患有晚期转移性乳腺癌的患者中5位经过MRI检测确认的BCBM患者和5位无BCBM患者作为研究对象。结果显示5/5BCBM患者和4/5BCBM患者的CTC基因特征与各自的临床组类聚(3-4a除此之外126个基因在这两组之间显著差异(3-4c)。随后研究者FACS分离CTC通过DEPArrayTM鉴定20CTC它们根据Ki67的平均荧光强度可分为11Ki67High CTC9Ki67Low CTC3-4b)。对这126个基因使用qPCR分析其中CD86PARP6GBP2的表达与BCBM基因特征显著一致ADAM17DDIT4SLC2A3SRGN基因在6-8/11Ki67High CTCs中的表达更高(3-4d)。BCBM CTCs还具有较高的CD44表达较低的CDH1表达和普遍较高的EMT评分。最后通路富集分析显示出Notch通路的活性更高BCBM CTCs中发现了新的造血和免疫逃逸信号通路(3-4e

 

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3-4 BCBM和无BCBM患者CTC转录组对比

 

总结

这项研究基于流式细胞术分离并获取CTC并在全基因组和转录组的层面对比研究了BCBM患者和pBC患者的差异验证了BCBM相关CTC的特定生物标志物和转录组学特征支持了CTC作为检测BCBM的临床筛查方法以弥补原有的放射学方法的不足。文章还重点研究了BCBM患者中生物标志物Ki67uPAR/int-β1的表达情况Notch信号通路的激活情况并在BCBM CTCs中发现了新的造血和免疫逃逸信号通路。这些特定的生物标志物或可应用于BCBM的早期检测上帮助制定专门针对BCBM的合理疗法评估疗效。

图示

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晶准医学简介

晶准医学成立于2018落户大湾区坐落于深圳坪山海科兴战略新兴产业园和香港科学园是一家集精准医疗液体活检技术研发、产品转化、生产、销售以及检测服务为一体的国家高新技术企业。公司拥有国际先进、自主知识产权的微流控技术与核酸检测技术为肿瘤液体活检提供全方位的精准诊断产品、方案以及服务。晶准医学在全国范围内率先推出全方位肿瘤液体活检整体解决方案致力于提供高效和精准的个体化肿瘤液体活检检测产品和服务实现肿瘤早诊早筛、精准诊断与实时监测。

公司技术力量雄厚在国内外数位院士的带领和指导下拥有数十位博士和硕士为主体的研发团队开展多项与肿瘤液体活检技术相关的科学研究与产品开发。公司核心技术微流控芯片上的细胞操控与检测技术平台荣获2015年国家教育部自然科学二等奖、2016年药明康德生命化学奖、2019年亚洲国际创新大奖(金奖)以及第47届日内瓦国际发明展金奖并在国际知名杂志上发表相关论文数十篇拥有多项发明专利。公司曾作为粤港合作典范受到了国家领导人习近平的关注并参观了研发实验室。由于公司发展迅速更是被德勤评为2019《香港明日之星企业(Hong Kong Rising Star)》且连续两届被评为粤港澳大湾区生物科技创新企业50强先锋企业。

img20公司拥有近3000平米的生产厂房建有万级洁净车间、十万级洁净车间、PCR实验室及晶益医学检验实验室。严格按照国家药品质量管理体系(GMP)、医疗器械质量管理体系(YYT0287/IS013485)、欧盟生产质量标准(CE)建立了完善的肿瘤液体活检所需的研发、生产及检测服务体系。

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A hallway with blue doors

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晶准医学产品系列

A picture containing indoor, computer, kitchen appliance

Description automatically generated一、晶准医学自主研发的首款CTC100循环肿瘤细胞分选仪已于20197月获国家药品监督管理局批准上市具有高效便捷、灵敏特异、样本需求少、应用广泛的特点全面领先目前市面上的同类产品。该设备已为临床提供CTC计数与分型信息免疫治疗靶向蛋白检测以及用药靶点基因检测等信息可拓展应用于全基因组测序、体外培养及药敏评估等为肿瘤早期筛查、预后判断、伴随诊断、复发预警、疗效监测等提供精准信息。

CELLOMICS 循环肿瘤细胞检测平台

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CELLOMICS 循环肿瘤细胞检测配套试剂盒

                                             

 

二、公司拥有“无需芯片”微滴式数字 PCR 平台已于20219月获国家药品监督管理局批准上市可实现微滴生成的自动化操作满足客户的高通量、自动化实验需求国际首创“无芯片式”微滴阵列打印技术突破传统微滴制备影响因素复杂、芯片耗材成本居高不下、易导致珍贵样本分析失败和损失的风险等局限大大降低了技术平台使用成本为肿瘤基因检测提供更精准、成本更低的检测平台。该平台可同时适用于肿瘤组织标本和血液标本适用于肺癌的EGFR低丰度突变检测肺癌的ALK融合基因检测乳腺癌的分型单细胞的基因表达分析甲基化分析外周血MicroRNA的绝对定量微小残留病变等临床应用。

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全球首创“无需芯片”数字PCR平台

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数字PCR配套试剂盒

三、基于高通量测序技术的早筛产品研发。公司与国际顶级医学院—美国希望之城医学院以及贝勒医学院进行核心专利授权转化。基于高通量技术以及独创的国际领先的生物信息学技术和算法检测消化道肿瘤患者ctDNA甲基化情况。可用于包括食管癌、胃肠以及结直肠癌等的早期筛查评估患癌风险临床符合率达93%。同时公司目前也正在联合多家医院开展基于液体活检miRNA组检测的结直肠癌和卵巢癌早筛产品大规模临床验证工作。

晶准医学项目特色

项目依托近20年研发积累的先进微流控技术和核酸检测技术提供全方位肿瘤液体活检整体解决方案应用于肿瘤诊断全程管理包括早诊早筛、辅助诊断、用药指导、实时监测等领域利用微流控技术建立高效多功能的CTC检测与研究平台;利用核酸检测技术高灵敏、高特异性地检测与肿瘤诊断相关的DNA与RNA信息为肿瘤诊断提供精准的多样化临床信息。

 

晶准医学荣誉

▪2015年教育部自然科学二等奖              

▪2016年获药明康德生命化学奖

▪2019年日内瓦国际发明展(金奖)          

▪2019年亚洲国际创新大奖(金奖)   

▪201921届中国国际高交会优秀产品奖

▪2019年深圳市创新创业大赛决赛

▪2019年工信部国际创新创业大赛香港季军

▪2019年第八届中国创新创业大赛行业总决赛

▪2019年德勤《香港明日之星企业 Hong Kong Rising Star 

▪2020年第三届粤港澳大湾区生物科技创新企业50——先锋企业

▪2021年第四届粤港澳大湾区生物科技创新企业50——先锋企业最受欢迎企业

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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