文献解读 02|《Science Advances》上皮-间质混合型CTC是转移的主要因素

上海交通大学Hongxia Wang团队于2019年在《Science Advances》期刊发表题为"Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with a restricted mesenchymal transition are a major"的论文,团队对上皮-间质转化(EMT)在转移性乳腺癌(MBC)疾病进展中的作用进行了研究。在小鼠模型和III、IV期MBC患者的临床队列中,E/m混合型循环肿瘤细胞(CTC)能够极大促进转移的形成。团队还通过CTC单细胞测序证明了EpCAM表达与CTC表型的相关性,EpCAM+ DTC(播散性肿瘤细胞)的比例可预测MBC患者转移状态与临床结局。

 

论文题图

 

癌症转移始于单个或成群的癌细胞从原发肿瘤组织脱落,随后通过血管内渗入血液。这些循环肿瘤细胞(CTC)最终可能从血管中外渗并扩散到肺部、肝脏或骨髓等远端,可称之为播散性肿瘤细胞(DTC)。在新的环境中,DTC可以保持单个细胞的状态或产生微转移,这可能会导致具有决定性的结果。

 

在本研究中,团队选用4T1 MBC小鼠模型来分析EMT对体外功能和体内致瘤能力的影响。通过在BALB/c小鼠的侧腹皮下移植4T1细胞,并收集原发肿瘤,血液,骨骼和器官,团队发现来自血液的4T1细胞系(CTC1)和来自骨髓的4T1细胞系(DTC1)与亲本4T1之间有着巨大的差异。首先,亲本4T1细胞显示出典型的上皮表型(E型),细胞之间紧密接触,CTC1显示出间质表型(M型),其细胞之间黏附力丧失,DTC1则保持了杂交表型,大多数DTC1保留了上皮表型,但仍有少量间质表型亚群(下图B),其次,4T1和DTC1有较高水平的EpCAM、E-cadherin表达,而CTC1则没有(下图C),最后,CTC1中上皮标志物EpCAM、E-cadherin、Rab25和Grhl2的mRNA水平显著降低,而间质标志物如N-cadherin、Vimentin、Slug、Zeb1和Zeb2的mRNA水平则显著增加(下图E)

 

在确定了4T1,CTC1和DTC1表型差异后,团队接着评估了三种细胞系的细胞代谢水平(4T1>DTC1>CTC1)、非贴壁依赖性生长(CTC1>DTC1>4T1)、对内皮细胞黏附率(DTC1>4T1>CTC1)、细胞迁移能力(CTC1>DTC1>4T1)和侵袭力(CTC1>DTC1>4T1),以探究EMT表型与肿瘤细胞的行为和功能之间的联系(下图F-J)这些结果表明,虽然CTC1的增殖能力和粘附性下降,但其迁移能力,非贴壁依赖性生长和侵袭能力得到增强;DTC1则在整体上得到了提升,在增强其粘附性的基础上,它还包括保留了一定程度的增殖能力,并略微提升了非贴壁依赖性细胞生长、迁移和侵袭能力

 

4T1 MBC小鼠模型中全身性癌细胞的EMT表型和体外功能特征

 

团队接着在小鼠模型中验证了三种细胞系的成瘤能力和转移能力。结果显示,DTC1移植小鼠瘤的平均重量和大小最高,且成瘤率100%(n=8);4T1移植的小鼠虽然均成瘤,但肿瘤重量相比DTC1显著降低;CTC1只有41.2%的成瘤率(7/17),且具有最低的平均肿瘤重量(下图A)。4T1和DTC1具有相同的转移率(80%);CTC1则在注射了超量癌细胞(2×106 vs 1.25×105)后才达到80%的成瘤率(下图C)因此,与4T1和DTC1相比,单个CTC1具有显著降低的致瘤和转移能力。下图D显示了CTC亚系从上皮到间质的表型转化过程。在E,E/m,M/e和M型细胞亚群中均能够观察到表型异质性,且他们不仅来自不同小鼠的CTC亚系,还可以来自同一只小鼠(下图E),这表明在单独的小鼠血液中存在具有不同EMT表型的CTCIHC染色发现M/e型CTC的EpCAM和E-cadherin表达量较低,而大多数E/m型CTC则具有较高的EpCAM和E-cadherin表达(下图F)

 

4T1、CTC1和DTC1的体内致瘤性和DTC1衍生CTC细胞系的EMT特征

 

为了研究三种细胞系在血液中发生肺转移的能力,团队对接入BALB/c小鼠的静脉(下图A)E型细胞(4T1),E/m型细胞(CTC6-6,CTC6-11,CTC8-1),M/e型细胞(CTC8-6,CTC8-5,CTC8-1)和M型细胞(CTC1)进行表面转移计数和体外转移群落形成测试。结果表明,与M和M/e型细胞相比,E和E/m型细胞具有增强的转移能力,混合表型(E/m型)CTC细胞系表现出最高的转移能力(下图B)

 

4T1、CTC1、DTC1移植动物的转移发生情况

 

团队分析了EpCAM表达与EMT表型的相关性,以判断EpCAM能否作为MBC临床样本的替代标志物。通过流式细胞术在4T1衍生的细胞系中定量EpCAM的表达,结果显示,从骨髓中再培养的DTC和从器官转移物中再培养的亚系均表达更高的EpCAM,并且从DTC1小鼠血液分离的CTC亚系,具有显著异质的EpCAM表达(下图A)。Spearman相关性分析显示EpCAM的高表达与较高的EMT评分呈负相关(r = −0.728,< 0.001)(下图B)因此,EpCAM的表达在原发性和全身性的4T1亚细胞系中的表达具有异质性,CTC中EpCAM的高表达与上皮表型的保留有关,在单个动物体内,血液CTC的EMT也具有高度异质性。研究人员在MBC患者中进一步探究了EMT异质性、EpCAM表达与CTC上皮型的相关性。结果显示,EpCAM在转移瘤中的表达更高(下图C),这也进一步验证了4T1 MBC小鼠模型的结果。通过检测EpCAM+(n=10)和EpCAM-(n=20)CTC中全基因组拷贝数变异(CNVs),发现与紧密连接(CLDN3,STRN和PTPN13)、有丝分裂细胞周期(CCNB1、SHB、EIF4EBP1、DUSP3和ABL1)、乳腺上皮细胞分化(ERBB4)和乳腺导管形态发生(GLI2和CSF1R)相关的基因得到了扩增,表明EpCAM+ CTC的细胞黏附、增殖和上皮分化的能力增加(下图D)

 

EpCAM表达与上皮型细胞和人类CTC具有相关性

 

研究人员最后评估了EpCAM表达与MBC患者转移状态和疾病结果的相关性。下图A展示了具有代表性的单个/集群CTC的SE-iFISH结果。团队在34个病人中共分离出845个CTC和71910个DTC,下图B-上展示了每个患者CTC和DTC数量的关联,与血液相比,骨髓中的细胞集群数量更高(下图B-中)EpCAM+ DTC的比例(65.9%)比EpCAM+ CTC的比例(22.4%)更高(下图B-下),34例患者中,20例(58.8%)血液中没有可检测的EpCAM+ CTC;12例(35.3%)骨髓中没有可检测的EpCAM+ DTC(下图C)临床结果表明CTC和DTC的高比例与可检测的器官转移呈正相关性,且高比例的EpCAM+ DTC与肺转移的发生显著相关(下图D)。对所有患者中位随访11个月,并通过受试者工作特征曲线(ROC)得知EpCAM+ DTC的比例能够准确预测MBC患者6个月死亡风险(AUC:0.785,CI:0.588-0.983,= 0.018)(下图E)其中EpCAM+ DTC比例大于20%的患者显示出总体生存期(OS)的严重下降(下图F)在排除了EpCAM二倍体CTC和DTC后,EpCAM+ CTC和DTC的比例分别下降到6.3%和56.9%。EpCAM+非整倍体CTC和DTC的比例与远端和肺转移相关(下图H),此外,EpCAM+非整倍体DTC的比例准确预测了MBC患者6个月的死亡风险(AUC:0.793,CI:0.599-0.988,= 0.015)(下图I)EpCAM+非整倍体DTC比例大于15%的患者显示出总生存期的严重下降(下图J)

 

EpCAM+全身性肿瘤细胞的比例与MBC患者的临床结局相关

 

总结:这项研究利用MBC小鼠模型来理解EMT在癌症转移中的作用,以准确概括MBC的临床情况。团队在MBC小鼠模型和III期和IV期MBC患者的临床队列中证实,具有混合E/m表型的CTC极大地促进了转移的形成,且EpCAM+ DTC可以准确预测患者6个月的生存期和总生存期。另外,由于在EMT转化过程中,CTC容易丢失EpCAM,因而依赖EpCAM的CTC富集方法(如CellSearch)将低估CTC的数量。定量CTC和DTC的数量并根据其EMT表型细分全身性肿瘤细胞,将有益改善对转移风险的预测并支持治疗决策。

 

 

晶准生物医学(深圳)临床医学科研部

 

参考文献:

[1] Liu X, Li J, Cadilha BL, et al. Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with a restricted mesenchymal transition are a major source of metastasis. Sci Adv. 2019;5(6):eaav4275. Published 2019 Jun 19. doi:10.1126/sciadv.aav4275

 
 
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